王禮賢， 李 琰， 康 山

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 1婦產(chǎn)超聲科 2分子生物室 3婦科，石家莊 050011

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是一種常見(jiàn)的婦科病，是具有生長(zhǎng)活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的地方而引起的疾病，約10%～15%的育齡期婦女患有此病，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。EMs臨床癥狀以痛經(jīng)、性交痛、月經(jīng)異常和不孕多見(jiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康[1]。盡管已有多種學(xué)說(shuō)和理論闡述EMs的病因，但其確切發(fā)病機(jī)制仍不明確。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明EMs可能是一種表觀遺傳學(xué)疾病，患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中存在許多異常甲基化基因[2]。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)是DNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，與DNA甲基化活性密切相關(guān)[3]。甲基化結(jié)合蛋白(methyl-CpG-binding domains，MBDs)在DNA甲基化過(guò)程中也起到了橋梁性的作用[4]。因此，本研究采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中DNMTs和MBDs的mRNA表達(dá)水平及其相關(guān)性，探討DNMTs和MBDs在EMs發(fā)生中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年9月～2015年12月期間就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科，行腹腔鏡手術(shù)治療并經(jīng)病理檢查證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的患者20例(平均年齡37.53±7.29歲)，分別取其子宮在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜(巧克力囊腫壁)；另選取同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)在本院行全子宮切除術(shù)的患者20例(平均年齡39.94±6.61歲)，取其子宮內(nèi)膜為對(duì)照內(nèi)膜，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常的子宮內(nèi)膜組織。兩組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。所有入選者既往月經(jīng)規(guī)律，3個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)激素治療，所取內(nèi)膜組織均為分泌期內(nèi)膜，且除外子宮內(nèi)膜單純性或復(fù)雜性增生、息肉等子宮內(nèi)膜病變。所有參與者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集

術(shù)中無(wú)菌采集卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜及對(duì)照組的子宮內(nèi)膜組織，放入RNAlater溶液(Carlsbad，美國(guó))中，-20℃保存。

1.3 RNA抽提和qRT-PCR檢測(cè)

分別取各組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組織，采用Trizol試劑盒(捷瑞，上海)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó))進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(總反應(yīng)體積10 mL，42℃ 60 min)，70℃15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20℃保存或立即使用熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒(Qiagen，德國(guó))以qRT-PCR儀(ABI，美國(guó))采用二步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依次加入Mix 10 μL，上下游引物各1.4 μL，Rox 0.1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 6.1 μL至最終體積20 μL，混勻離心。反應(yīng)條件設(shè)定為預(yù)變性95℃15 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃35 s，40個(gè)循環(huán)。各引物序列(表1)采用Primer 5在線軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，各組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05表示二者之間有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 3組子宮內(nèi)膜中DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的mRNA表達(dá)水平比較

DNMT1 mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.0122(0.0103～0.0220)、0.0038(0.0024～0.0061)、0.0043(0.0034～0.0056)，其中，在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的DNMT1 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P=0.031)，而在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.464)；DNMT3A mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.0111(0.0059～0.0141)、0.0034(0.0021～0.0056)、0.0044(0.0029～0.0075)，其中，在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的DNMT3A mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P=0.027)，而在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.796)；DNMT3B mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.0013(0.0007～0.0027)、0.0007(0.0004～0.0010)、0.0006(0.0003～0.0009)，其中，在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的DNMT3B mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005，P=0.020)，而在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.676)。見(jiàn)圖1。

*P<0.05,**P<0.01圖1 3組內(nèi)膜中DNMTs的mRNA表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of DNMTs mRNA expression levels in the endometrium of the three groups

2.2 DNMT1、DNMT3A及DNMT3B mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性

DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的mRNA表達(dá)水平呈一定程度的兩兩正相關(guān)。其中，DNMT1與DNMT3A的相關(guān)性系數(shù)r為0.370(P=0.006)；DNMT1與DNMT3B的相關(guān)性系數(shù)r為0.306(P=0.025)；DNMT3A與DNMT3B的相關(guān)性系數(shù)r為0.287(P=0.035)。

2.3 3組內(nèi)膜中MBD1、MBD2、MBD3及MBD4的mRNA表達(dá)水平比較

MBD1 mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.0281(0.0160～0.0359)、0.0210(0.0103～0.0396)、0.0099(0.0085～0.0115)，其在異位內(nèi)膜的表達(dá)水平明顯低于在位內(nèi)膜和對(duì)照內(nèi)膜，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027，P<0.01)，在位內(nèi)膜與對(duì)照內(nèi)膜的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.540)；MBD2 mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別是0.0723(0.0461～0.1185)、0.0320(0.0212～0.0475)、0.0283(0.0188～0.0578)，其在在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，P=0.003)，異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.828)；MBD3 mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別是0.0170(0.0092～0.0279)、0.0032(0.0023～0.0040)、0.0137(0.0063～0.0164)，其在在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.602)；MBD4 mRNA在對(duì)照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量分別是0.0314(0.0230～0.0520)、0.0306(0.0194～0.0438)、0.0319(0.0179～0.0866)，3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.596)。見(jiàn)圖2。

*P<0.05，**P<0.01圖2 3組內(nèi)膜中MBDs的mRNA表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of MBDs mRNA expression levels in the endometriums of the three groups

2.4 MBD1、MBD2、MBD3及MBD4 mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性

MBD1與MBD2、MBD3及MBD4 mRNA表達(dá)水平之間無(wú)明顯的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.279(P=0.103)、0.028(P=0.831)、0.134(P=0.308)；MBD2與MBD3 mRNA表達(dá)水平之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.326(P=0.011)；MBD2與MBD4 mRNA表達(dá)水平之間無(wú)明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r為0.057(P=0.665)；MBD3與MBD4 mRNA表達(dá)水平之間無(wú)明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r為0.167(P=0.201)。

2.5 DNMTs與MBDs mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性

MBD2與DNMT1、DNMT3A之間呈一定程度的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.294(P=0.027)、0.261(P=0.048)，其余兩兩之間無(wú)明顯相關(guān)性，詳見(jiàn)表2。

表2 DNMTs與MBDs mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性Table 2 Correlation between DNMTs and MBDs mRNA expression levels

3 討論

DNA甲基化是真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的主要方式之一，在胚胎發(fā)育、組織分化、腫瘤及其它疾病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，越來(lái)越多的證據(jù)表明EMs患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中存在許多基因，由于DNA甲基化水平的改變導(dǎo)致其表達(dá)異常，使參與EMs相關(guān)的激素和炎癥因子發(fā)生改變，從而在EMs的發(fā)生和發(fā)展中起了一定的作用[5]。

DNMTs是DNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其家族成員主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是一種維持甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)于維持DNA甲基化水平非常重要。DNMT3A和DNMT3B是從頭合成的甲基轉(zhuǎn)移酶，主要參與構(gòu)建甲基化[6]。Rhee等[7]認(rèn)為體內(nèi)DNMTs被破壞時(shí)，其活性幾乎消失，從而導(dǎo)致基因組低甲基化。EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中DNMTs異常表達(dá)可影響DNA的甲基化水平及后期轉(zhuǎn)錄合成，從而影響EMs的發(fā)生和發(fā)展。以往的研究表明EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中DNMTs存在著異常表達(dá)，但結(jié)果不一。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與EMs患者的在位內(nèi)膜相比，其異位內(nèi)膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA水平均升高。Szczepanska等[9]認(rèn)為，與正常內(nèi)膜相比，EMs患者的在位內(nèi)膜中DNMT3A mRNA表達(dá)升高，其他DNMTs表達(dá)水平不變。本研究發(fā)現(xiàn)EMs患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)均低于正常內(nèi)膜。Van Kaam等[10]報(bào)道，EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中DNMT1和DNMT3B表達(dá)水平明顯低于正常內(nèi)膜，這一結(jié)論與我們的結(jié)果一致。對(duì)于學(xué)者們不同的研究結(jié)果，筆者認(rèn)為可能是由于人群不同、標(biāo)本不同及樣本量不同所致。本研究的對(duì)象為中國(guó)華北地區(qū)女性分泌期的子宮內(nèi)膜組織，而其他研究有些是增殖期子宮內(nèi)膜，有些則是純化的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。此外，Hermann等[11]認(rèn)為正常的DNA甲基化水平需要DNMTs三者聯(lián)合起來(lái)共同維持，即DNMT1的維持甲基化功能可以保證DNMT3A和DNMT3B重新甲基化程序的啟動(dòng)，而DNMT3A和DNMT3B又可以提升整體的甲基化水平。Rhee等[7]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)破壞DNMT1或DNMT3B不會(huì)改變結(jié)直腸癌細(xì)胞中的特異性甲基化，只有當(dāng)兩者同時(shí)都被破壞時(shí)，大部分基因組的DNA甲基化才被消除。我們的研究首次研究了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平之間確實(shí)呈一定程度的正相關(guān)。

DNA甲基化過(guò)程中，除了DNMTs發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶的作用之外，還需MBDs特異性識(shí)別甲基化位點(diǎn)，招募組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)至該區(qū)域，引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄[12-13]。本研究探討了MBDs家族中的MBD1、MBD2、MBD3及MBD4在EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中的mRNA表達(dá)水平。這也是首次在EMs中將4成員結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究。

本世紀(jì)初，Shiraishi等[12]就發(fā)現(xiàn)MBD1可選擇性地與單個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MBD1也能與未發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄[14]。換言之，不論甲基化水平如何，MBD1都能夠翻譯轉(zhuǎn)錄CpG二核苷酸的信號(hào)，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制[15]。已發(fā)現(xiàn)MBD1在許多惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均升高，如結(jié)腸癌和胰腺癌等[16]。MBD2能招募HDAC至甲基化CPG位點(diǎn)，引起組蛋白去乙?；瘡亩l(fā)基因沉默[4]。MBD3的作用是在MBD2存在的條件下被招募至甲基化位點(diǎn)，二者相互作用從而增強(qiáng)MBD2與甲基化DNA的親和力[17]。MBD4能結(jié)合單個(gè)對(duì)稱(chēng)甲基化CpG位點(diǎn)，識(shí)別CpG位點(diǎn)錯(cuò)配的T并進(jìn)行修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性[18]。本研究結(jié)果表明EMs異位內(nèi)膜中MBD1 mRNA表達(dá)水平明顯低于在位內(nèi)膜和對(duì)照內(nèi)膜，而在位內(nèi)膜與對(duì)照內(nèi)膜的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中MBD2與MBD3的mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照內(nèi)膜，而異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜之間無(wú)顯著差異；MBD4 mRNA在3組內(nèi)膜中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。以往的研究表明，EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中MBDs mRNA表達(dá)水平與正常內(nèi)膜存在差異，但結(jié)果也不一致。其中，Van Kaam等[10]研究認(rèn)為EMs患者的在位和異位內(nèi)膜中MBD1與MBD2 mRNA異常表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。而林曉斌等[19]卻認(rèn)為EMs患者的異位內(nèi)膜中MBD2 mRNA表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜。通過(guò)相關(guān)性分析，我們還發(fā)現(xiàn)MBD2與MBD3 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)，筆者認(rèn)為其原因可能是由于MBD3可與MBD2相互作用，從而增強(qiáng)MBD2與甲基化DNA的親和力所致。Pontes等[20]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中MBD2和MBD3的mRNA表達(dá)較正常胃黏膜組織均明顯減少。此外，Stirzaker等[21]報(bào)道，MBD2可以與DNMT1和DNMT3A結(jié)合，在特定區(qū)域中的易患癌甲基化頻譜的改變上發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)MBD2與DNMT1、DNMT3A mRNA表達(dá)水平之間呈不同程度的正相關(guān)。這意味著MBD2除了發(fā)揮自身作用之外，還可能與DNMT1和DNMT3A之間相互作用，從而參與EMs中異常DNA甲基化水平的維持與調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EMs患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中存在DNMTs與MBDs mRNA的異常表達(dá)，并且各DNMTs mRNA的表達(dá)水平之間，以及MBD2與MBD3、DNMT1、DNMT3A的mRNA表達(dá)水平之間均呈正相關(guān)，這為進(jìn)一步了解了DNA甲基化異常在EMs病因中的作用提供了理論依據(jù)。