邱 敏， 李曉紅， 黃茲銳， 陳 景， 周成斌， 陳寄梅， 莊 建△

（1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510641；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省心血管病研究所，廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點實驗室，廣東廣州510080）

吸煙會增加吸煙者罹患各種腫瘤和心血管疾病等的風(fēng)險，同時孕期煙草或尼古丁的暴露對母體和胎兒的健康均有不良影響［1-2］。吸煙也是導(dǎo)致過早死亡的主要原因。尼古丁作為香煙中的一種關(guān)鍵化合物，除了上癮外，它還可能導(dǎo)致各種不良的健康問題。大量的研究報道尼古丁對干細(xì)胞的增殖、分化、遷移等均有不同程度的影響［3-4］，且其機制與多種煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）有關(guān)，尼古丁是這些受體重要的激動劑［5］。而干細(xì)胞中本身的以及尼古丁暴露后的nAChRs 的表達(dá)差異有待而進一步研究。本研究以4 種干細(xì)胞——人胚胎干細(xì)胞系H9、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC）為研究對象，觀察尼古丁處理前后這些細(xì)胞上nAChRs 表達(dá)情況及變化，為探究尼古丁的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 H9 細(xì)胞和IPSC（北京賽貝生物技術(shù)有限公司）；BMMSC（賽業(yè)生物科技有限公司）；UCMSC來自健康足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶（已獲得廣東省人民醫(yī)院倫理審批及產(chǎn)婦知情同意）。

1.2 試劑 尼古丁和胰酶（Sigma-Aldrich）；E8 人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基和人多潛能干細(xì)胞消化液（含EDTA）均購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12 和澳洲胎牛血清（Gibco）；Matrigel（BD）；青霉素和鏈霉素（華北制藥公司）；RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑（Solarbio）；TBST 緩沖液（上海生工生物工程股份有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）和SYBR Premix Ex Taq? II試劑盒（TaKa-Ra）；瓊脂糖、TAE 和 DNA 染液（Thermo Fisher）；PVDF膜（Millipore）；SDS-PAGE預(yù)制膠（Genscript）。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma）；T25 培養(yǎng)瓶和6 孔培養(yǎng)板（無錫耐思生物科技有限公司）；載玻片（Invitrogen）；凝膠電泳儀（北京華圣科儀實驗設(shè)備有限公司）；Western blot 電泳槽（Bio-Rad）；FACSAria 分光光度計（BD）；酶標(biāo)儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；SimpliAmp 梯度PCR儀（Thermo Fisher Scientific）；5810R 離心機和5415R冷凍離心機（Eppendorf）；NanoDrop 2000超微量生物檢測儀（Gene Company Limited）；ViiA 7 熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；SP5-FCS激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及尼古丁處理

2.1.1 H9 細(xì)胞與IPSC 培養(yǎng) 用復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇后，觀察細(xì)胞形態(tài)并于48 h 后更換E8 培養(yǎng)基，期間用EDTA 進行消化傳代，所有使用的培養(yǎng)板和瓶均用低生長因子基質(zhì)膠包被至少1 h。

2.1.2 UCMSC 分離及培養(yǎng) 用PBS 洗滌剪碎后的健康足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶，加入0.2% Ⅱ型膠原酶、青霉素和鏈霉素消化6 h；過濾并將濾液離心，沉淀重懸，接種到培養(yǎng)皿中。觀察細(xì)胞貼壁之后，更換培養(yǎng)基，可進行傳代培養(yǎng)、凍存等后續(xù)操作，取第3～5代進行實驗。

2.1.3 BMMSC 培養(yǎng) 使用DMEM/F12 加10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)，期間用0.25%胰酶-EDTA 進行消化傳代。

4 種細(xì)胞均鋪在6 孔板中，培養(yǎng)在37℃、5% CO2溫箱中，尼古丁加入相應(yīng)培養(yǎng)基中配成濃度為1 μmol/L 的尼古丁處理液，待細(xì)胞密度待到生長成60%～70%時，處理組更換為尼古丁處理液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。以上實驗重復(fù)3次以上。

2.2 總蛋白提取及Western blot 檢測nAChRs 蛋白水平 采用RIPA 裂解緩沖液（并加入PMSF）從細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，取30 μg 蛋白溶解產(chǎn)物進行電泳，然后轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，條件為恒壓110 V、150 min，之后PVDF 膜用5%的牛奶在TBST緩沖液中低速搖床上封閉1 h，在4℃條件下與I抗（抗nAChRs 各種亞基的抗體）孵育過夜，然后用TBST 洗滌3次，在4℃條件下，孵育相對應(yīng)的II抗，約45 min，取適量A、B 兩種顯影試劑，按照1∶1 的比例混合配置成顯影液，顯影后檢測nAChRs蛋白表達(dá)情況。以上實驗重復(fù)3 次以上。所用抗體的詳細(xì)情況見表1。

2.3 總 RNA 提取及 RT-PCR 檢測 nAChRs 的 mRNA水平 細(xì)胞接種于6 孔板用PBS 洗3 次之后，每孔加入1 mL TRIzol，冰上裂解5 min，然后收集到EP 管，每管加入氯仿200 mL，震蕩后室溫靜置10 min，隨后4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清于新的EP 管，加入 500 mL 異丙醇，震蕩15 s，靜置10 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min，棄上清。加入 1 mL 冷 75%乙醇，混合后4℃、7 500 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)2 次，適度晾干，加入適量無酶水溶解，測濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR 條件:93℃預(yù)變性；93℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s 進行 35次循環(huán)；72℃保溫7 min。引物序列見表2。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 Western blot及細(xì)胞免疫熒光實驗用抗體Table 1.The description of the antibodies used in Western blot（WB）and cellular immunofluorescence（IF）

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測nAChR 的表達(dá)位置 細(xì)胞用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定過夜10 min，0.1%Triton 滲透。載玻片在封閉液中封閉1 h，用抗nAChRs各種亞基的抗體在4℃孵育過夜。PBS洗后，用驢抗兔免疫球蛋白IgG（H+L）孵育載玻片，用DAPI進行核染色。用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照。使用的抗體如表1所示。

2.5 RT-qPCR 檢測尼古丁處理前后nAChRs的表達(dá)變化 使用TRIzol 試劑提取的并純化RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。根據(jù)制造商（TaKaRa）的說明，使用SYBR Premix Ex Taq? II 主混合試劑盒進行qPCR。引物序列見表2。將被測基因的Ct 值與內(nèi)參照GADPH 的Ct 值進行歸一化，得到各基因的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞在T25 瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)均一，狀態(tài)良好。各類型的細(xì)胞形態(tài)存在明顯差異，成體干細(xì)胞（BMMSC 和UCMSC）呈梭形，旋渦狀生長；H9 細(xì)胞和IPSC是圓形，克隆樣生長，見圖1。

2 nAChRs亞基的mRNA表達(dá)水平

RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂凝膠電泳顯示，H9 細(xì)胞表達(dá)α2、α3、α4、α7、α9、β1 和β2；IPSC 表達(dá)α3、α4、α7、α9、β1 和β2；BMMSC 表達(dá)α2、α3、α7、α9 和β1；UCMSC表達(dá)α2、α3、α4、α7、α9、β1和β2，見圖2。

表2 PCR相關(guān)引物序列Table 2.The sequences of the primers for PCR

Figure 1.The morphological observation of different stem cells（scale bar=400 μm）.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cell；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.圖1 各種干細(xì)胞的形態(tài)觀察

3 nAChRs亞基的蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，在蛋白水平，2 種胚胎干細(xì)胞的nAChRs 亞基表達(dá)較一致，H9 細(xì)胞和IPSC 中均表達(dá)α2、α3、α4、α7、α9和β1；而在成體干細(xì)胞中，UCMSC 表達(dá)α2、α3、α4、α7、α9 和β1 這6 種nAChRs亞基，類似于多能干細(xì)胞，BMMSC 僅表達(dá)α4、α7、α9和β1這4種nAChRs亞基，見圖3。

4 nAChRs亞基的免疫熒光檢測

細(xì)胞中受體表達(dá)雖有差異，但在4 種細(xì)胞中的定位無明顯差異，其中α3亞基主要位于細(xì)胞核，α4、α9 和β1 亞基位于細(xì)胞質(zhì)中，α2 和α7 亞基位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，見圖4。

5 尼古丁對nAChRs表達(dá)的影響

比較尼古丁處理48 h 后細(xì)胞中nAChR 的mRNA水平，與對照組相比，H9 細(xì)胞的α2 和α9 顯著下調(diào)（P＜0.01），而α3、α4 和β1 顯著上調(diào)（P＜0.01）；IPSC中，α2、α3和β2顯著上調(diào)（P＜0.01）；BMMSC 中，β2顯著上調(diào)（P＜0.01）；而UCMSC 中，α2 和β2 顯著下調(diào)（P＜0.01）。見圖5。

Figure 2.The mRNA expression of nAChR subunits in various stem cells detected by RT-PCR and showed by agarose gel electrophoresis.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.M:DNA marker；GAP:GAPDH.圖2 RT-PCR 和瓊脂糖凝膠電泳檢測各種干細(xì)胞內(nèi)nAChRs亞基的mRNA表達(dá)

Figure 3.The protein expression of nAChR subunits in various stem cells detected by Western blot.H9:stem human embryonic cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.圖3 Western blot 檢測各種干細(xì)胞內(nèi)nAChRs 亞基的蛋白表達(dá)

討 論

雖然尼古丁的毒理作用被廣泛研究，但其致病機制或者對細(xì)胞功能的調(diào)控機制仍需進一步探索。而胚胎、胚胎樣及成體干細(xì)胞具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力，亦可成為體外多種疾病研究的細(xì)胞模型［6］，因此成為臨床和科研的關(guān)注熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，電子煙成分的氣溶膠能對H9 細(xì)胞產(chǎn)生毒性［7］，而尼古丁可誘導(dǎo)非人靈長類動物的胚胎干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變［8］。還有報道指出，尼古丁抑制間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）的再生，MSC 在低濃度尼古丁作用下增殖被抑制，而相對高濃度的尼古丁則促進其增殖［9-10］。這些研究表明，尼古丁等環(huán)境因素在干細(xì)胞的廣泛運用過程中會起一定的影響作用，然而對于干細(xì)胞中以尼古丁為激動劑的nAChRs的表達(dá)情況目前還鮮有報道。因此，我們研究了干細(xì)胞中nAChRs 亞基的表達(dá)以及其受尼古丁調(diào)控的影響，并試圖揭示其規(guī)律。

nAChRs 屬于配體門控通道受體，由各種不同亞基組成的同源及異源性五聚體構(gòu)成，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)存在 16 個亞基（α1～7、α9～10、β1～4、δ、ε 和γ），其中α1、β1、δ、ε 和 γ 屬于肌肉型受體，其余是神經(jīng)性型受體［11］。本研究發(fā)現(xiàn) H9 細(xì)胞、IPSC、UCMSC 和BMMSC 明顯表達(dá)nAChRs 部分亞基，但情況各不相同。在 mRNA 和蛋白水平上，H9 細(xì)胞、IPSC 和UCMSC 均表達(dá) α2、α3、α4、α7、α9 和 β1。IPSC 是認(rèn)為誘導(dǎo)的具有胚胎干細(xì)胞特性的一類細(xì)胞，這可能解釋了H9細(xì)胞與IPSC的受體表達(dá)情況相似的原因。而蛋白水平上，BMMSC 僅部分受體亞基表達(dá)明顯。同時，所有這些受體亞基可能在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮作用。然而，在蛋白水平上，4 種細(xì)胞均未檢測到β2亞基的表達(dá)。β2亞基對nAChRs中乙酰膽堿等結(jié)合位點和有效離子通道的形成是不可或缺的［12］，其他亞基與β2 形成結(jié)合體已被多項研究報道是尼古丁發(fā)揮作用的重要成分。4 種細(xì)胞均源自人類，但分化存在差異，與成熟的分化組織距離不同，因此我們的結(jié)果提示干細(xì)胞的分化潛能越高，表達(dá)nAChRs 亞基的種類就越多。細(xì)胞免疫熒光檢測到同一受體在不同類型細(xì)胞上的定位是一致的，但不同受體亞基之間的定位存在差異，可以表達(dá)于細(xì)胞核，也可以表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，也有的同時位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，因此我們推測不同nAChRs可能在不同的時間和空間上發(fā)揮不同的功能。

尼古丁作為nAChRs的激動劑，對受體的改變可能是影響細(xì)胞功能的原因。1 μmol/L 的濃度接近吸煙者血液中尼古丁生理濃度的均值［13］，因此本研究選擇1 μmol/L 濃度的尼古丁處理細(xì)胞。我們也猜測不同干細(xì)胞的nAChRs 被尼古丁影響的情況可能與分化潛能有聯(lián)系。在尼古丁處理后，本研究亦發(fā)現(xiàn)nAChRs 亞基表達(dá)發(fā)生變化，且在不同細(xì)胞中變化不一致，其中分化潛能最高的H9 細(xì)胞中多種受體亞基均發(fā)生改變，提示H9 細(xì)胞對尼古丁的高敏感性，即分化潛能越高，對尼古丁的調(diào)控越敏感。另外，尼古丁作用后α2 亞基在H9 細(xì)胞中上調(diào)，而在IPSC 和UCMSC 中表達(dá)下調(diào)。α2的研究目前較少，其改變與酒精、吸煙等效應(yīng)有關(guān)，在大量吸煙青少年中表達(dá)增加［14］。這些差異可能是不同細(xì)胞對尼古丁的敏感性存在差異的原因。α7 作為調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增殖分化等多種功能的受體亞基［15］，在本研究中未檢測到尼古丁對其表達(dá)的明顯影響。因此，我們發(fā)現(xiàn)尼古丁對干細(xì)胞中nAChRs 的調(diào)控確實存在，但是α7 亞基的穩(wěn)定性最強，在多種干細(xì)胞中均不受生理濃度下的尼古丁調(diào)控，這也解釋了α7 在多種細(xì)胞中發(fā)揮重要作用且被廣泛報道的原因，但具體機制需進一步探究。

Figure 4.The expression of nAChR subunits in different stem cells was detected by immunofluorescence staining（scale bar=50 μm）.DAPI staining was performed to visualize nuclei（blue），while the nAChR subunits exhibited red or green fluorescence.圖4 免疫熒光檢測nAchRs亞基在各種干細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression levels of nAChR subunits in various stem cells treated with 1 μmol/L nicotine were detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 1 μmol/L的尼古丁處理前后各種干細(xì)胞中nAChRs亞基mRNA表達(dá)的變化

本研究對多種干細(xì)胞中尼古丁受體及尼古丁暴露后受體的變化進行了探究，發(fā)現(xiàn)不同干細(xì)胞中nAChRs 亞基存在表達(dá)差異，表明這些細(xì)胞對尼古丁的敏感性也是有差異的，需要進一步研究不同亞基的具體功能及其在疾病發(fā)生的作用。同時，考慮到干細(xì)胞的分化潛能高低及其所處的時期，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)的尼古丁影響干細(xì)胞nAChRs 亞基表達(dá)的情況，我們推測尼古丁可能在胚胎生長發(fā)育早期的影響更大，但需要進一步研究證實。而尼古丁使干細(xì)胞發(fā)生表觀遺傳學(xué)的改變可能也是重要且值得進一步研究的機制。