袁宗勝 劉芳 穆景利 周麗麗 黃貞勝 林靜 謝寶貴

摘要?[目的]研究解淀粉芽孢桿菌JL-B05的生物學(xué)特性及生理生化指標(biāo)。[方法]對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05進(jìn)行平板培養(yǎng)，并對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色，獲得解淀粉芽孢桿菌JL-B05的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征;采用溫度梯度和pH梯度法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌JL-B05的最適培養(yǎng)條件，繪制其40 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線，并對(duì)其生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]解淀粉芽孢桿菌JL-B05菌落顏色為白色，菌落邊緣不平整，菌體呈桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，有芽孢，無(wú)莢膜;解淀粉芽孢桿菌JL-B05最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最佳生長(zhǎng)pH為7。[結(jié)論]對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05進(jìn)行生物學(xué)特性及生理生化指標(biāo)的測(cè)定，為后續(xù)系統(tǒng)研究解淀粉芽孢桿菌JL-B05及生產(chǎn)復(fù)合微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?解淀粉芽孢桿菌;生物學(xué)特性;最適培養(yǎng)條件;生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)?Q93?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）14-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.001

Abstract?[Objective]To study the biological characteristics and physiological & biochemical indexes of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05.[Method]The culture characteristics and morphology characteristics of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 were obtained by plate culture，Gram staining，spore staining and capsule staining，and the optimum culture conditions of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 were determined by temperature gradient and pH gradient method，the growth curves of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 were plotted within 40 hours，and their physiological & biochemical indexes were determined.[Result]The colony color of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 was white，the colony edge was uneven，the bacteria were rod-shaped，Gram-positive，there were spores and no capsule.The optimum culture temperature of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 was 25?℃，the optimum growth pH was 7.[Conclusion]The biological characteristics and physiological & biochemical indexes of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 were determined，which laid the foundation for the subsequent systematic study of?Bacillus amyloliquefaciens?JL-B05 and the production of compound microbial agents.

Key words?Bacillus amyloliquefaciens;?Biological characteristics;Optimal culture conditions;Physiological & biochemical indexes

植物內(nèi)生細(xì)菌指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并且與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌[1]。內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要在促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面[2-6]，如?Microbacterium?具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[7]，?Bacillus具有良好的生防潛力[8]，Sphingomonas?對(duì)植物自我修復(fù)功能[9]等。筆者選用從毛竹體內(nèi)分離并篩選出的具有促生、拮抗功能的解淀粉芽孢桿菌JL-B05[10]，研究其生物學(xué)特性，即最適生長(zhǎng)溫度、最適pH、生長(zhǎng)曲線及其生理生化指標(biāo)，為內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌JL-B05的應(yīng)用及其復(fù)合微生物菌劑的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試菌株?解淀粉芽孢桿菌JL-B05，由福建農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究中心篩選出的具有較好促生、拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌。

1.2?培養(yǎng)基

1.2.1?NA培養(yǎng)基。內(nèi)生菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2 （液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。

1.2.2?淀粉水解培養(yǎng)基。蛋白棟 5.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，可溶性淀粉 2.0 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2。

1.2.3?產(chǎn)H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基。蛋白胨 10.0 g，酵母浸膏 3.0 g，牛肉膏 3.0 g， FeSO4 0.2 g，硫代硫酸鈉 0.3 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2.4?葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基。牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 3.0 g，K2HPO4 2.0 g，2.0%溴麝香草酚藍(lán)溶液 12.0 mL，葡萄糖 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2.5?硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基。蛋白胨 10.0 g，NaNO3 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.6。

1.2.6?檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基。檸檬酸鈉 5.0 g，NaCl 5.0 g，MgSO4 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，（NH4）H2PO4 1.0 g，瓊脂 20.0 g，1%溴百里酚蘭液 8 mL，蒸餾水 1 000 mL， pH 6.8。

1.2.7?丙二酸利用試驗(yàn)培養(yǎng)基。酵母浸膏 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，K2HPO4 0.6 g，KH2PO4 0.4 g，NaCl 2.0 g，丙二酸鈉 3.0 g，1%溴百里酚蘭液 3 mL，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.8。

1.2.8?V-P試驗(yàn)及甲基紅培養(yǎng)基。蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，磷酸二氫鉀5.0 g;蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2。

1.2.9?硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基。蛋白胨5.0 g，酵母膏3.0 g，硝酸鉀1.0 g，瓊脂粉7.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2;

1.2.10?吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基。胰蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.11?石蕊牛乳培養(yǎng)基。新鮮的脫脂牛乳100 mL加入2.5% 石蕊水溶液至淡紫色（約4 mL）。

1.3?主要試劑?HCl溶液、NaOH溶液、碘液、95%乙醇、番紅液、草酸結(jié)晶紫、5%孔雀綠染色液、1%醋酸結(jié)晶紫、20% CuSO4水溶液。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4?解淀粉芽孢桿菌JL-B05生物學(xué)特性研究

1.4.1?解淀粉芽孢桿菌JL-B05的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征。

取供試解淀粉芽孢桿菌JL-B05接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，包括菌體形狀和芽孢形態(tài)等重要鑒別特征。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)菌形態(tài)觀察方法參照東秀珠等[11]、方中達(dá)[12]。

1.4.2?溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05生長(zhǎng)的影響。在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后將解淀粉芽孢桿菌JL-B05 按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基試管中，分別置于15、20、25、30、35、40 ℃?6個(gè)溫度梯度下、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以不接種解淀粉芽孢桿菌JL-B05的NB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測(cè)定 OD600值，以確定其生長(zhǎng)的最適溫度。

1.4.3?pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05生長(zhǎng)的影響。在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，用 1 mol/L HCl 或 1 mol/L NaOH 調(diào)整液體培養(yǎng)基的初始pH，使培養(yǎng)基pH梯度為 3、4、5、6、7、8、9、10，并且每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，接種解淀粉芽孢桿菌JL-B05，30 ℃下180 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600，以確定其生長(zhǎng)的最適pH。

1.4.4?培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05生長(zhǎng)的影響。在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按1%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌JL-B05，30 ℃下 180 r/min，振蕩培養(yǎng)。以開(kāi)始放搖床振蕩培養(yǎng)進(jìn)行第一次取樣，測(cè)量其OD600值。以后按每 2 h定時(shí)取樣，測(cè)定菌液的 OD600值。

1.5?解淀粉芽孢桿菌JL-B16生理生化指標(biāo)的測(cè)定

解淀粉芽孢桿菌JL-B05生理生化指標(biāo)測(cè)定的項(xiàng)目主要有接觸酶、氧化酶、厭氧生長(zhǎng)、V-P、明膠液化、甲基紅、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、7%NaCl生長(zhǎng)、淀粉水解等。測(cè)定方法參照東秀珠等[11]。

2?結(jié)果與分析

2.1?解淀粉芽孢桿菌JL-B05生物學(xué)特性分析

2.1.1?解淀粉芽孢桿菌JL-B05培養(yǎng)特征和形態(tài)特征。

取供試解淀粉芽孢桿菌JL-B05接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落顏色為白色，菌落邊緣不平整，通過(guò)顯微鏡觀察菌體呈桿狀。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，結(jié)果顯示解淀粉芽孢桿菌JL-B05為革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢，無(wú)莢膜。

2.1.2?溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05生長(zhǎng)的影響。

從圖1可以看出，解淀粉芽孢桿菌JL-B05隨著培養(yǎng)溫度的逐步升高OD600值也逐步升高，培養(yǎng)溫度達(dá)25 ℃時(shí)OD600值最大。在25～30 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的增加OD600值呈下降趨勢(shì)，在35～40 ℃時(shí)OD600值呈穩(wěn)定并逐步下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，解淀粉芽孢桿菌JL-B05 的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃。

2.1.3?pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌JL-B05生長(zhǎng)的影響。從圖2可以看出，隨著pH的升高，解淀粉芽孢桿菌JL-B05菌液的OD600值逐步升高，待pH為7時(shí)達(dá)到最高值，隨后OD600隨pH的增加呈下降趨勢(shì)。即最佳生長(zhǎng)pH為7。