馬寶霞，沈文璐，王旭，李澤，徐坤

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100

隨著ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas等特異性人工核酸酶技術(shù)的發(fā)展，基因編輯從早期的基因打靶逐漸發(fā)展為以特異性核酸酶為基礎(chǔ)的完善的基因編輯技術(shù)體系。目前廣泛應(yīng)用的主要是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)[1]，通過(guò)這些技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高效的基因敲除 (Knock-out，KO)、敲入 (Knock-in，KI)、精確的點(diǎn)編輯 (Point editing，PE) 以及單堿基編輯 (Base editing，BE)。早期的基因打靶通過(guò)打靶載體與胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cell，ES) 中目標(biāo)基因位點(diǎn)的自發(fā)同源重組實(shí)現(xiàn)外源基因的敲入，然后把成功打靶的ES細(xì)胞移植回囊胚，通過(guò)胚胎移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該技術(shù)存在著效率低、周期長(zhǎng)、費(fèi)用高以及嵌合體等缺點(diǎn)。隨后人們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)大型核酶在目標(biāo)基因位點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂后，能夠大大提高打靶載體的重組效率，進(jìn)而有效提高基因打靶的效率。為了能夠定制特異性識(shí)別基因組DNA靶序列的核酸內(nèi)切酶，人們相繼開(kāi)發(fā)了基于鋅指蛋白 (ZFP)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物 (TALE) 的ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)。這兩種技術(shù)分別通過(guò)ZFP和TALE重復(fù)單元識(shí)別目標(biāo)基因靶序列，由與之融合的核酸內(nèi)切酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域進(jìn)行DNA定點(diǎn)切割，進(jìn)而通過(guò)基因組DNA的自發(fā)或誘導(dǎo)修復(fù)實(shí)現(xiàn)基因編輯[2-3]。但是，ZFNs和TALENs核酸酶的構(gòu)建過(guò)程繁瑣且活性并不能得到有效保證。CRISPR/Cas9技術(shù)由負(fù)責(zé)靶向的導(dǎo)向RNA (sgRNA或gRNA) 和負(fù)責(zé)切割的Cas9核酸酶組成，相比于傳統(tǒng)的ZFNs和TALENs技術(shù)更為簡(jiǎn)單，只需要針對(duì)特定靶序列設(shè)計(jì)構(gòu)建相應(yīng)sgRNA，便能實(shí)現(xiàn)高效的DNA切割，進(jìn)而介導(dǎo)有效的基因編輯。除了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于基因編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)還 有CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas12b[4]。CRISPR/Cas技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、成本低和效率高等優(yōu)點(diǎn)，受到了科研工作者們的廣泛青睞，但同時(shí)也存在著脫靶效應(yīng)的問(wèn)題。Base editor (BE) 技術(shù)是在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的單堿基編輯技術(shù)，能夠在不引入DNA雙鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的定點(diǎn)突變，分為能夠?qū)崿F(xiàn)C＞T突變的CBE技術(shù)和A＞G突變的ABE技術(shù)。

理論上，早期廣義的基因編輯技術(shù)包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)。不過(guò)，近年來(lái)轉(zhuǎn)基因技術(shù)特指將外源基因轉(zhuǎn)入到受體生物中的技術(shù)，而狹義基因編輯則相對(duì)地特指轉(zhuǎn)基因之外的對(duì)生物體基因組目標(biāo)基因的特定修飾。得益于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，人類疾病基因編輯動(dòng)物模型的廣泛應(yīng)用極大地推動(dòng)了人類疾病的相關(guān)研究。目前，應(yīng)用于人類疾病研究的基因編輯動(dòng)物模型主要有小鼠、大鼠和豬等，相關(guān)的制備方法主要有原核注射法和體細(xì)胞克隆法。本文將簡(jiǎn)要介紹基因編輯動(dòng)物模型 (包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型) 在神經(jīng)退行性疾病、肥厚心肌病、癌癥、免疫缺陷類疾病和代謝性疾病等5種人類疾病研究中的應(yīng)用情況，以期為以后的相關(guān)研究及動(dòng)物模型制備提供借鑒。

1 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因編輯動(dòng)物模型

神經(jīng)退行性疾病以腦功能的逐漸喪失為特征，主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、感覺(jué)缺失、記憶和運(yùn)動(dòng)能力喪失等，包括阿爾茲海默癥 (Alzheimer's disease，AD)、亨廷頓病 (Huntington's disease，HD)、帕金森癥 (Parkinson's disease，PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥 (Amyotrophic lateral sclerosis，ALS) 等，影響著全世界數(shù)以百萬(wàn)計(jì)人的生活。目前，這些神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制尚不清楚，暫無(wú)有效的治療措施。研究工作者們相繼對(duì)多種動(dòng)物進(jìn)行基因組改造，制備了鼠、豬、羊和靈長(zhǎng)類等動(dòng)物模型[5]，為神經(jīng)退行性疾病的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1.1 AD基因編輯動(dòng)物模型

AD是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，病因迄今未明。研究表明該病的神經(jīng)病理標(biāo)志是β-淀粉樣蛋白沉積形成的細(xì)胞外老年斑和Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生等。這些病變最終使人逐漸喪失認(rèn)知功能，導(dǎo)致癡呆[6-8]。

目前，研究工作者們已開(kāi)發(fā)了100多個(gè)AD相關(guān)基因工程小鼠品系，但只有少數(shù)被廣泛應(yīng)用，主要有淀粉樣斑塊沉積、血管淀粉樣沉積和Tau病理學(xué)的轉(zhuǎn)基因鼠模型[9]。然而，小鼠模型不能表現(xiàn)出神經(jīng)原纖維纏結(jié)或神經(jīng)元丟失等病癥，不適合用于AD相關(guān)研究[10-11]。豬在生理學(xué)等方面與人類具有相似之處，早在2009年，Kragh等[12]利用手工克隆技術(shù)得到了7只G?ttingen小型豬模型，發(fā)現(xiàn)Aβ肽在大腦中的積累可能在1–2歲時(shí)發(fā)生。Jakobsen等[11]也得到了攜帶人類基因的雙轉(zhuǎn)基因Gttingen小型豬(PSEN1M146I和APPsw轉(zhuǎn)基因)。用Aβ42特異性抗體免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)到10月齡和18月齡豬腦組織中Aβ42在神經(jīng)元內(nèi)有所積累，推測(cè)是AD的發(fā)病前兆。這些轉(zhuǎn)基因豬模型表現(xiàn)出了一定的AD癥狀，有效促進(jìn)了早期AD研究，但是目前尚未建立一種具有代表性的豬或其他動(dòng)物完全疾病模型。

1.2 HD基因編輯動(dòng)物模型

HD是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，由編碼亨廷頓蛋白 (Huntingtin，HTT) 的基因突變引起。亨廷頓基因的第1外顯子CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增，使得編碼的突變HTT含有超長(zhǎng)多聚谷氨酰胺 (Polyglutamine，Poly Q)，突變HTT錯(cuò)誤折疊，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致人的認(rèn)知、精神和運(yùn)動(dòng)功能障礙，同時(shí)伴有體重減輕和肌肉萎縮等癥狀[13-15]。

為了進(jìn)一步探索如何有效治療HD，學(xué)者們相繼開(kāi)發(fā)了各種動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量研究。2017年，Su等[16]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)了4種gRNA對(duì)HD140Q-Ki小鼠的Poly Q進(jìn)行敲除，有效改善了HD小鼠模型的神經(jīng)毒性，并指出非等位基因特異性CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯可以有效、永久地消除成人大腦內(nèi)多谷氨酰胺擴(kuò)張介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性。2018年，Yan等[17]利用體細(xì)胞核移植 (SCNT) 和CRISPR/Cas9技術(shù)，將150個(gè)CAG重復(fù)序列插入豬成纖維細(xì)胞的HTT基因中，成功建立了一種內(nèi)源性表達(dá)全長(zhǎng)突變體HTT的HD豬模型 (圖1)，具有明顯的神經(jīng)變性，可作為治療該病的理想模型。這是世界上首次建立的模擬HD的大型哺乳動(dòng)物模型，該研究也強(qiáng)調(diào)了利用大型哺乳動(dòng)物研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制及其治療方法的重要性。

1.3 PD基因編輯動(dòng)物模型

PD是一種常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)性疾病，常發(fā)于中老年期，其病理特征是黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，從而引起肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和靜止性震顫等癥狀[18]。

早在2009年就有學(xué)者提出慢性MPTPp方案可用于研究PD的慢性病理過(guò)程和神經(jīng)保護(hù)策略，是一種漸進(jìn)的PD小鼠模型[19]，但小鼠模型不能完全模仿PD的癥狀，相對(duì)來(lái)說(shuō)，MPTP猴模型更能明顯準(zhǔn)確地模仿PD的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[20]。2015年，Zhou等[21]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)與SCNT相結(jié)合的方法有效獲得了PARK2與PINK1雙基因靶向敲除豬 (圖2)。經(jīng)過(guò)免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)Parkin蛋白和PINK 1在該基因編輯豬的神經(jīng)元中無(wú)法表達(dá)，而且PD的典型癥狀并未在7月齡活突變豬身上觀察到，這與人類神經(jīng)退行性疾病隨著年齡增長(zhǎng)愈漸明顯的病程相似，因此是很好的PD研究模型。同年，van Kampen等[22]建立了PD大鼠模型，為PD的治療研究作出了一定貢獻(xiàn)。

圖1 利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立的HD基因編輯 (敲入) 豬模型[17]Fig.1 HD gene edited (KI) pig model established by CRISPR-Cas9 technique[17].

圖2 利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立的PD基因編輯 (敲除) 豬模型[21]Fig.2 PD gene edited (KO) pig model established by CRISPR-Cas9 technique[21].

1.4 ALS基因編輯動(dòng)物模型

ALS是一種致死性神經(jīng)退行性疾病，通過(guò)選擇性侵犯運(yùn)動(dòng)皮層、腦干和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來(lái)控制肌肉活動(dòng)[23]，臨床表現(xiàn)為肌張力喪失、癱瘓、肌肉萎縮和痙攣，最終導(dǎo)致癱瘓和死亡[24-26]。大多數(shù)患者表現(xiàn)為發(fā)散性ALS，5%–10%的患者表現(xiàn)為家族性ALS，家族性ALS可由至少32個(gè)已知基因位點(diǎn)中的一個(gè)突變引起，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)、TRA DNA結(jié)合蛋白43 (TDP-43)、肉瘤融合蛋白 (FUS) 和C9ORF72[27-30]。

Flis等[31]使用了人SOD1基因G93A突變體的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠研究了游泳訓(xùn)練對(duì)ALS小鼠骨骼肌能量代謝及握力下降的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明游泳訓(xùn)練對(duì)ALS小鼠骨骼肌能量代謝有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也能改善骨骼肌功能。Morrice等[32]在文章中指出，TDP43-Q331K轉(zhuǎn)基因小鼠模型在朊病毒蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在10個(gè)月齡時(shí)能表現(xiàn)出進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙、肌肉萎縮、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性等許多類似ALS的癥狀，但這種表現(xiàn)在20個(gè)月內(nèi)就停止，并且小鼠不會(huì)死亡。該模型無(wú)法進(jìn)一步對(duì)ALS的治療方法進(jìn)行研究，因此，更有效的動(dòng)物模型尚有待建立。

2 肥厚型心肌病HCM的基因編輯動(dòng)物模型

肥厚型心肌病 (Hypertrophic cardiomyopathy，HCM) 是由編碼肉瘤相關(guān)蛋白的基因突變導(dǎo)致的一種常染色體顯性遺傳的心肌細(xì)胞疾病，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞紊亂、間質(zhì)纖維化和左心室肥厚等，且60%的HCM患者具有明顯的家族性疾病[33]。早期研究發(fā)現(xiàn)，MYH7和MYBPC3基因是編碼肉瘤相關(guān)蛋白的常見(jiàn)基因，相關(guān)基因還包括TNNT2、TPM1、ACTC1、MYL2等[33]。

2017年，Marian等[33]利用同源重組和體細(xì)胞克隆的方法，將R403Q突變敲入豬的MYH7基因中，獲得基因突變的雜合小型豬模型。該模型豬在3個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出HCM的輕微癥狀，血清肌鈣蛋白Ⅰ升高，心肌纖維和心臟收縮能力增強(qiáng)，間質(zhì)纖維化和肌細(xì)胞紊亂，到1歲時(shí)，22頭R403Q豬中有11頭死于心臟性猝死，而所有的野生型豬都存活了下來(lái)。因此，該模型的建立對(duì)研究新的HCM治療方法具有重要意義。此外，Montag等[34]利用TALENs技術(shù)，將引起HCM的相關(guān)突變點(diǎn)R723G引入豬成纖維細(xì)胞的MYH7基因中，成功地克隆出了具有R723G突變的MYH7基因的雜合豬，建立了人類心血管疾病基因編輯豬模型 (圖3)。新生豬表現(xiàn)出輕微的HCM的特征，包括輕度肌細(xì)胞混亂、畸形核和MYH7過(guò)度表達(dá)。上述基因編輯豬模型為研究人類心臟疾病的致病機(jī)制和長(zhǎng)期發(fā)展提供了重要的材料。

3 癌癥基因編輯動(dòng)物模型

3.1 肺癌基因編輯動(dòng)物模型

2017年，Wang等[35]利用TALENs和SCNT建立了在Cre酶誘導(dǎo)下表達(dá)Cas9的基因編輯豬，成功誘導(dǎo)了豬肺癌相關(guān)的5個(gè)抑癌基因 (TP 53、PTEN、APC、BRCA 1和BRCA 2) 以及一個(gè)原癌基因 (KRAS) 的突變，率先在體內(nèi)利用基因組編輯技術(shù)建立原發(fā)性肺癌大動(dòng)物模型。該基因編輯豬的建立，極大地促進(jìn)與癌癥相關(guān)基因的體內(nèi)功能研究。

3.2 慢性淋巴細(xì)胞白血病基因編輯動(dòng)物模型

慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL) 是一種具有成熟表型的B細(xì)胞惡性腫瘤疾病。T細(xì)胞白血病-1癌基因 (TCL 1) 是一種AKT共激活因子，是成熟T細(xì)胞白血病的病因，在幾乎所有CLL患者中都有高表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠具有獨(dú)特的免疫表型和類似人類B-CLL過(guò)程的白血病，已被廣泛應(yīng)用。

Simonetti等[36]對(duì)多種CLL轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究，確定了Eμ-TCL 1轉(zhuǎn)基因小鼠TCL 1-TG在免疫表型、BCR儲(chǔ)備和病程等方面與侵襲型人CLL最為相似。TCL 1過(guò)表達(dá)具有100%的疾病外顯率，因此對(duì)闡明CLL的致病機(jī)制具有重要意義。白血病細(xì)胞TCL 1-TG供體可通過(guò)腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)注射移植到同基因野生型或免疫缺陷小鼠 (如SCID) 中，以加速疾病的發(fā)展，并產(chǎn)生一個(gè)基因同源的白血病小鼠群體，從而可以系統(tǒng)地研究新的治療方法，而無(wú)需等待其在非移植動(dòng)物中的自然進(jìn)程。TCL 1-TG小鼠模型已被廣泛研究，與人的U-CLL具有高度相似性[37]。

圖3 利用TALENs技術(shù)建立的HCM基因編輯 (點(diǎn)編輯) 豬模型[34]Fig.3 HCM gene edited (PE) pig model established by the TALENs technique[34].

4 免疫缺陷類疾病基因編輯動(dòng)物模型

4.1 重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病基因編輯動(dòng)物模型

重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病 (Severe combined immunodeficiency，SCID) 是一種體液免疫和細(xì)胞免疫均有嚴(yán)重缺陷的疾病，以T細(xì)胞免疫缺陷更為突出。動(dòng)物體內(nèi)X染色體上的白細(xì)胞介素-2受體共同γ鏈基因 (IL-2RG) 編碼的受體蛋白對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[38]，因此IL-2RG缺陷將導(dǎo)致NK細(xì)胞活性降低甚至喪失，從而導(dǎo)致SCID的發(fā)生。

2013年，Watanabe等[39]向豬的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入ZFN表達(dá)載體后，靶向敲除了細(xì)胞的IL2RG基因，通過(guò)SCNT得到的IL2RG-KO豬，經(jīng)檢測(cè)，該豬表現(xiàn)出的癥狀與人類SCID相似。隨后，Lee等[40]利用TALEN系統(tǒng)靶向修飾了豬體細(xì)胞的RAG2，經(jīng)SCNT、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植后，RAG2基因修飾豬發(fā)育成熟為三胚層畸胎瘤，這說(shuō)明此RAG2-KO豬具有免疫缺陷的表型，是一種成功的SCID動(dòng)物模型。Huang等[41]利用TALEN和SCNT技術(shù)成功克隆出RAG1/2雙敲豬，這種仔豬主要表現(xiàn)為免疫器官發(fā)育不良，成熟的B、T淋巴細(xì)胞大量減少而且淋巴細(xì)胞V (D) J基因片段重排消失，是明顯的SCID特征。2016年，Suzuki等[42]用基因靶向成纖維細(xì)胞核移植的方法制備出了IL2RG和RAG 2雙基因敲除豬，表現(xiàn)為混合表型更嚴(yán)重的IL2RG或RAG 2消融，與IL2RG和RAG 2單基因敲除豬相比，前者可作為異種移植研究的良好平臺(tái)。

4.2 獲得性免疫缺陷綜合征基因編輯動(dòng)物模型

獲得性免疫缺陷綜合征 (Acqired immre deficiency syndrome，AIDS) 病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，被定名為人類免疫缺陷病毒 (HIV)，主要攻擊并大量破壞人體免疫系統(tǒng)中最重要的CD4+T淋巴細(xì)胞，使得機(jī)體細(xì)胞免疫功能顯著降低，最終導(dǎo)致機(jī)體感染病原體的機(jī)會(huì)增加或產(chǎn)生惡性腫瘤而死亡。ZFN、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)可能從多個(gè)HIV儲(chǔ)存庫(kù)中清除或破壞HIV整合基因組或HIV感染細(xì)胞，這為將來(lái)完全治愈AIDS提供了技術(shù)支持[43]。

Karpinski等[44]使用SILPE進(jìn)化出一種新的重組酶 (Brec1)，該重組酶位點(diǎn)能特異性地識(shí)別長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (LTRs) 中存在的34 bp序列，有效而精確地去除整合的HIV-1原病毒，并被發(fā)現(xiàn)對(duì)許多臨床HIV-1分離物及用病人來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)的小鼠都有效。Holt等[45-46]設(shè)計(jì)以17%的頻率破壞人CD 34+造血干/祖細(xì)胞中的CCR5 (HIV-1感染所需的受體)，用ZFN處理細(xì)胞移植免疫缺陷小鼠，產(chǎn)生了穩(wěn)定破壞CCR5的多系后代。接受未處理細(xì)胞和CCR5病毒攻擊的對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的CD4+T細(xì)胞丟失，而用ZFN修飾細(xì)胞移植的小鼠則接受快速選擇CCR 5[47]。Yuan等[48]還發(fā)現(xiàn)在HIV-1感染的NSG小鼠體內(nèi)植入ZFN修飾的CXCR 4 CD4+T細(xì)胞，對(duì)利用CXCR 4進(jìn)行組織培養(yǎng)的HIV-1具有抵抗力。除ZFN外，CRISPR/Cas9也可有效破壞HIV-1感染所需的細(xì)胞基因和整合的HIV-1前病毒DNA[43]，表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒9個(gè)載體和多重gRNAs對(duì)動(dòng)物整合的HIV-1 DNA的切割有影響，可切除小鼠脾、肝、心、肺、腎和循環(huán)淋巴細(xì)胞中大量必需的前病毒DNA片段[49]。

5 代謝性疾病基因編輯動(dòng)物模型

5.1 家族性高膽固醇血癥基因編輯動(dòng)物模型

家族性高膽固醇血癥 (Familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H) 是一種造成人體脂代謝紊亂的遺傳性疾病，突變的低密度脂蛋白受體會(huì)引發(fā)低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、黃瘤和嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化性血管等臨床癥狀[50]。利用TALEN打靶技術(shù)、CRISPR/Cas9進(jìn)行基因組編輯可以建立新的代謝性疾病模型。

2012年，Carlson等[51]通過(guò)TALEN打靶技術(shù)敲除了豬成纖維細(xì)胞基因組的LDLR，經(jīng)SCNT后得到了含有LDL受體基因單核和雙等位基因突變的微型豬，可作為家族性高膽固醇血癥的模型，這對(duì)模擬人類FH等脂代謝綜合疾病具有非常重要的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值。2017年，Huang等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)豬胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行編輯，并經(jīng)SCNT后得到ApoE–/–和LDLR–/–雙基因敲除豬，該研究首次獲得脂代謝紊亂的基因修飾豬模型。同年，Jarrett等[53]介紹了以肝臟為導(dǎo)向的體細(xì)胞基因組編輯作為代謝紊亂模型的一種方法，用AAV-CRISPR載體破壞小鼠Ldlr基因，使其在肝臟中發(fā)展為嚴(yán)重的高膽固醇血癥以及系統(tǒng)性代謝表型——?jiǎng)用}粥樣硬化，以上模型均為研究代謝性疾病機(jī)理和治療手段創(chuàng)造了重要的平臺(tái)。

5.2 糖尿病基因編輯動(dòng)物模型

糖尿病是一種終生代謝性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。大鼠和小鼠動(dòng)物模型越來(lái)越多地被用來(lái)闡明類型1和類型2糖尿病機(jī)制以及識(shí)別和提煉新的治療方法。

2015年，馬元武等[54]用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備出了胰島素受體底物1 (Irs 1) 和瘦素受體(Lepr) 基因敲除大鼠 (圖4)，并伴隨著肥胖、血脂異常、輕度血糖升高等癥狀。Claussnitzer等[55]也用此技術(shù)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)基因攜帶者與其前體脂肪細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行基因編輯，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)關(guān)鍵核苷酸對(duì)Fto(與肥胖癥關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的基因) 的重要作用：當(dāng)T被C取代時(shí)，脂質(zhì)堆積；當(dāng)C轉(zhuǎn)變?yōu)門時(shí)，停止儲(chǔ)存脂肪。通過(guò)對(duì)此核苷酸的編輯，成功逆轉(zhuǎn)了小鼠的肥胖癥，為治療肥胖癥以及由肥胖引起的糖尿病提供了素材。2016年，Naylor等[56]同樣應(yīng)用此技術(shù)敲除了大鼠INS-1胰腺β-細(xì)胞系中的Glp-1r或Gipr(治療糖尿病的重要藥物靶點(diǎn)[57])，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Glp-1r和GIP相結(jié)合的雙重激動(dòng)劑在體內(nèi)外都能與其受體結(jié)合，且平衡的雙重激動(dòng)劑能夠顯著改善葡萄糖耐量。

6 總結(jié)與展望

基因編輯技術(shù)為生命科學(xué)研究提供了最新的技術(shù)手段，隨著其不斷發(fā)展和完善，使得各種人類疾病動(dòng)物模型的制備成為可能，極大地推動(dòng)了人類疾病相關(guān)研究。本文主要針對(duì)神經(jīng)退行性疾病、家族性肥厚心肌病、癌癥、免疫缺陷類疾病和代謝性疾病等5種疾病類型概括了相關(guān)基因編輯鼠和豬模型的應(yīng)用情況 (表1)。此外，猴子等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在神經(jīng)學(xué)、生理學(xué)、解剖學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、遺傳學(xué)等各方面與人類最為接近，近年來(lái)也逐漸作為動(dòng)物模型應(yīng)用于人類疾病、智力和神經(jīng)學(xué)研究[58-60]。不過(guò)，以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停泊嬖谥鴰滋幦秉c(diǎn)：一是實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高；二是其身體結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)難度大；三是具有智力，存在著社會(huì)倫理方面的局限性[61-62]。相信隨著基因編輯技術(shù)的繼續(xù)完善，基因編輯動(dòng)物模型將在人類疾病研究中進(jìn)一步被廣泛應(yīng)用。

圖4 利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立的糖尿病基因編輯大鼠模型[52]Fig 4 A diabetes gene editted rat model established by CRISPR/Cas9 technique[52].

如本文中所述，通過(guò)基因編輯技術(shù)制備基因編輯動(dòng)物模型的方法主要有原核注射法和體細(xì)胞克隆法，應(yīng)用于人類疾病研究的基因編輯動(dòng)物模型主要有小鼠、大鼠和豬等動(dòng)物模型。其中，基因編輯鼠模型一般通過(guò)原核注射法制備，相對(duì)于大動(dòng)物模型具有制作成本低、周期短、操作方便等優(yōu)點(diǎn)；但是鼠類在機(jī)體各方面與人類差異較大，且壽命短，作為疾病模型的有效性和可信度尚有待商榷。另外，通過(guò)原核注射法制備基因編輯動(dòng)物模型只能在產(chǎn)后進(jìn)行基因型鑒定，且存在嵌合體的問(wèn)題，對(duì)于大動(dòng)物模型的制備不夠經(jīng)濟(jì)有效，尤其是針對(duì)基因編輯效率低 (比如依賴于同源重組機(jī)制的基因敲入、替換和點(diǎn)編輯)、動(dòng)物繁殖力低和繁殖周期長(zhǎng)等情況。另一方面，基因編輯豬模型主要通過(guò)體細(xì)胞克隆法制備，豬相對(duì)于鼠類在生理學(xué)、解剖學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和遺傳學(xué)等各方面與人類都有相似之處，且相對(duì)于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有快速繁殖(性成熟5–6個(gè)月) 和產(chǎn)仔數(shù) (平均7–8只仔豬) 的明顯優(yōu)勢(shì)，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于人類疾病研究，并取得了一定的成果。通過(guò)體細(xì)胞克隆法制備基因編輯動(dòng)物的策略，能夠在動(dòng)物產(chǎn)前進(jìn)行核供體細(xì)胞的陽(yáng)性鑒定，因此動(dòng)物在產(chǎn)后陽(yáng)性率高，相對(duì)原核注射法大動(dòng)物生產(chǎn)成本低。不過(guò)，體細(xì)胞克隆法技術(shù)含量要求較高，除了體細(xì)胞核移植技術(shù)外，核供體細(xì)胞的分離、編輯和陽(yáng)性篩選也是其中的關(guān)鍵。本文通訊作者及其研究團(tuán)隊(duì)在前期的研究中先后開(kāi)發(fā)了源于嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus的StCas9系統(tǒng)、紅綠雙熒光報(bào)告技術(shù)[63]和基因編輯陽(yáng)性細(xì)胞的RPG輔助報(bào)告篩選(SSA-based Purorand mRFP-eGFP surrogate reporters) 技術(shù)[64-65]；其中，基因編輯陽(yáng)性細(xì)胞的篩選有效解決了體細(xì)胞克隆法中核體細(xì)胞的篩選問(wèn)題。之后，團(tuán)隊(duì)新近開(kāi)發(fā)的CRISPR/Rad52-Cas9系統(tǒng)[66]和sgRNA-shRNA/Cas9系統(tǒng)[67-68]分別從Rad52-Cas9融合表達(dá)和sgRNA-shRNA協(xié)同作用兩個(gè)方面有效提高了同源重組介導(dǎo)的基因編輯效率。這些研究成果為以后通過(guò)基因編輯技術(shù)制備動(dòng)物模型的相關(guān)研究提供了有力的技術(shù)支持。不過(guò)，目前在基因編輯動(dòng)物制備過(guò)程中尚不能實(shí)現(xiàn)高效的雙等位基因編輯，相關(guān)技術(shù)有待進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。