劉 敏, 韓海斌, 劉愛萍，*, 高書晶, 徐林波, 岳方正, 黃海廣

(1. 中國農業(yè)科學院草原研究所, 呼和浩特 010000; 2. 國家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲害防治總站, 沈陽 110034; 3. 內蒙古自治區(qū)林業(yè)科學研究院, 呼和浩特 010000)

茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebustestaceipes是一種寄生性天敵，寄主蚜蟲種類廣泛，包括危害經濟作物的麥二叉蚜Schizaphisgraminum、棉蚜Aphisgossypii、玉米蚜Rhopalosiphummaidis和大豆蚜Aphisgylcnies以及豆科牧草和沙生植物的苜蓿蚜Aphiscraccivora等(Rodrigues and Bueno, 2001; Silvaetal., 2008; 劉興龍等, 2009)。滯育是指昆蟲在不利環(huán)境條件下受到某些信號的刺激，通過體內一系列生理生化變化，使其生長、發(fā)育和繁殖暫時停止的生命現象，是對不利環(huán)境的遺傳性適應(Tauberetal., 1986; Saunders, 2002)，滯育一旦開始，不會因為環(huán)境條件的轉變而立即解除滯育，通常會持續(xù)一段時間(劉流等, 2010)。滯育不僅可以幫助昆蟲度過不良環(huán)境，維持個體的生存；而且可以使昆蟲種群發(fā)育整齊，提高雌雄個體間的交配機率，保證種群的繁衍(王滿囷和李周直, 2004)。利用茶足柄瘤蚜繭蜂滯育特性來延長其產品的貨架期，可以更好地防治害蟲。目前國內外對寄生蜂滯育的研究主要包括誘導滯育的條件、滯育特征、滯育的親代效應、滯育后發(fā)育、滯育的分子機制等(張洪志等, 2018)。隨著基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等生物技術近年來的快速發(fā)展與廣泛應用，昆蟲滯育的機理正逐步被揭示。滯育期間，昆蟲的血淋巴或脂肪體中存在某些蛋白質，且濃度較高，隨著滯育的終止，這些蛋白質逐漸消失，而在非滯育昆蟲中無此類蛋白質(或僅有極微量痕跡)，它們被認為與昆蟲滯育的發(fā)生有關，稱為滯育關聯(lián)蛋白(diapause-associated protein, DAP)。昆蟲在滯育過程中，代謝速率緩慢，形態(tài)上無變化，也無組織分化和器官發(fā)育，但生理過程仍繼續(xù)進行，如神經分泌、脂類代謝及糖類代謝等(Duboisetal., 1956; Haykawa and Chino, 1981; Puirouxetal., 1989)。昆蟲能夠在極端環(huán)境條件下成功存活正是由于這種特殊的生理代謝機制(Mansingh, 1971; Storey and Storey, 1988; Denlinger, 1991)。

能量代謝是有機體在物質代謝過程中所伴隨能量釋放、轉移、貯存與利用的過程，昆蟲利用這些能量來維持生命活動。為探究昆蟲滯育過程中能量代謝分子機制，本研究根據實驗室前期研究基礎，對茶足柄瘤蚜繭蜂進行滯育誘導，采用iTRAQ技術比較茶足柄瘤蚜繭蜂滯育組與非滯育組的蛋白含量，并結合生物信息學方法揭示了茶足柄瘤蚜繭蜂滯育期間蛋白的變化規(guī)律，篩選出與能量代謝相關的滯育關聯(lián)蛋白并分析功能，為深入分析茶足柄瘤蚜繭蜂滯育機理提供參考。 這一工作對研究昆蟲滯育分子機理與應用天敵防治害蟲具有重要意義，同時也可為滯育后害蟲發(fā)生量與發(fā)生期預測預報提供一種依據。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源和樣品收集

1.1.1試蟲來源：載體植物蠶豆Viciafaba苗為室內培育，寄主苜蓿蚜采自中國農業(yè)科學院草原研究所沙爾沁基地的羊柴Hedysarummongolicum植株上，將苜蓿蚜轉接在溫室內的水培蠶豆苗上繁殖，確保接在蠶豆苗上的苜蓿蚜未被天敵寄生，接蟲后對蠶豆苗進行籠罩(100目防蟲網)，在溫室內飼養(yǎng)5代以上作為供試寄主蟲源。從中國農業(yè)科學院草原研究所沙爾沁基地的羊柴植株上采集被寄生的苜蓿蚜僵蚜，從中挑取茶足柄瘤蚜繭蜂未羽化破殼的僵蚜置于人工氣候箱溫度(25±1)℃，相對濕度(70±1)%，光周期14L∶10D條件下培養(yǎng)，挑選羽化后茶足柄瘤蚜繭蜂轉移至試管(10 cm×3 cm)內，用20%的蜂蜜水作為補充營養(yǎng)，接入上述實驗室條件下培養(yǎng)的苜蓿蚜2-3齡若蚜上，在室溫下養(yǎng)蟲籠中按照足柄瘤蚜繭蜂∶苜蓿蚜=1∶100釋放成對剛羽化茶足柄瘤蚜繭蜂和苜蓿蚜，建立茶足柄瘤蚜繭蜂種群作為供試蟲源。 茶足柄瘤蚜繭蜂在室溫下用苜蓿蚜有效擴繁10代以上，取羽化24 h內的成蜂待用。

1.1.2樣品收集：根據實驗室前期研究基礎可知，苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育120 h，此時僵蚜體內寄生蜂處于高齡幼蟲(3-4齡)階段，高齡幼蟲為茶足柄瘤蚜繭蜂感受滯育信號的敏感蟲態(tài)，將此時的僵蚜放入人工氣候箱中進行滯育誘導。高齡幼蟲處于滯育環(huán)境條件時，并不會立刻停止發(fā)育，而是繼續(xù)發(fā)育一段時間，經實驗驗證，當發(fā)育至蛹時，便不再繼續(xù)發(fā)育(孫程鵬, 2018)。本研究中，基于1.1.1節(jié)中供試蟲源，誘導茶足柄瘤蚜繭蜂滯育的溫光組合為溫度8℃和光周期8L∶16D，誘導時長為30 d。選取經過30 d滯育誘導的僵蚜300頭,解剖出茶足柄瘤蚜繭蜂活蛹, 50頭/管放入液氮中速凍暫時保存，然后作為滯育組樣品放入-80℃冰箱中保存；苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，放置在(25±0.5)℃、RH (70±5)%、光周期14L∶10D、光照強度8 800 lx(人工氣候箱，上海一恒公司MGC-HP系列)條件下，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育168 h(此時蚜繭蜂處于蛹態(tài))，對300頭僵蚜進行解剖，挑選飽滿、有活力的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹, 50頭/管放入液氮中速凍暫時保存，然后作為非滯育組樣品放入-80℃冰箱中保存。

1.2 滯育組與非滯育組茶足柄瘤蚜繭蜂蛋白提取

蛋白質提取采用裂解液法(徐珊珊等, 2008)。采用考馬斯亮藍法(Bradford 法)(胡文霞,2011)測定蛋白濃度。取100 μg蛋白樣品，加入適量蛋白溶解液(8 mol/L尿素， 100 mmol/L TEAB, pH 8.5)補足體積至100 μL，胰蛋白酶(1 μg/μL) 2 μL和TEAB緩沖液(100 mmol/L) 500 μL，混勻后于37℃酶切過夜，取上清通過C18除鹽柱進行脫鹽處理，然后加入足量iTRAQ標記試劑(溶于異丙醇)，室溫下顛倒混勻反應1 h，取等體積標記后的蛋白樣品混合，除鹽后凍干。配制流動相A液(2%乙腈和98%水，氨水調至pH 10)和B液(98%乙腈和2%水，氨水調至pH 10)。使用1 mL A液溶解標記后的混合樣品粉末，離心后取1 mL上清進樣。經過脫鹽處理, 真空干燥，每分鐘收集1管，凍干后各加入0.1%甲酸溶解，經高效液相色譜 (HPLC) 預分離。配制流動相A液(100%水和0.1%甲酸)和B液(80%乙腈和0.1%甲酸)。對收得餾分上清各取2 μg樣品進樣，液質檢測。使用Q ExactiveTMHF-X質譜儀，進行二級質譜檢測。

1.3 數據分析

使用軟件Discoverer2.2對生成質譜檢測的原始數據(.raw)進行查庫鑒定及定量分析。Discoverer2.2軟件對檢索結果做了進一步過濾以提高分析結果質量，降低假陽性率，可信度在95%以上的肽段匹配譜圖(peptide spectrum matches, PSMs)為可信PSMs，至少包含一個特有肽段的蛋白為可信蛋白，只保留可信的PSMs和蛋白，經錯誤發(fā)現率(false discovery rate, FDR)驗證去除FDR>5%的肽段和蛋白。將每個蛋白在滯育組和非滯育組中的所有生物學重復定量值均值的比值作為差異倍數(fold change, FC)。為了判斷差異的顯著性，將每個蛋白在滯育組和非滯育組樣品中的相對定量值進行了T檢驗，并計算相應的P值，以此作為顯著性指標。當FC≥2.0，同時P≤0.05時，蛋白表現為表達量上調;當FC≤0.50，同時P≤0.05時，蛋白表現為表達量下調。

利用GO功能顯著性富集分析將滯育組和非滯育組樣品差異表達蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)向Gene Ontology數據庫(http:∥www.geneontology.org/)的各個term映射，計算每個term的蛋白質數目，然后應用超幾何檢驗找出與所有蛋白質背景相比，在DEPs中顯著富集的GO條目(term)。其計算公式：

其中N為所有蛋白中具有GO注釋信息的蛋白數目，n為N中差異蛋白的數目，M為所有蛋白中注釋到某個GO條目的蛋白數目，X為注釋到某個GO條目的差異蛋白數目。計算得到P值，以P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異蛋白質中顯著富集的GO term。通過GO顯著性分析能確定DEPs行使的主要生物學功能。

利用KEGG pathway顯著性富集分析方法對滯育組和非滯育組樣品DEPs進行功能富集分析，確定DEPs參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

2 結果

2.1 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達蛋白

本研究中定量蛋白總數為7 251個，根據1.3節(jié)中篩選差異蛋白的條件，對定量到的蛋白進行篩選，滯育組與非滯育組中DEPs有135個，滯育組上調表達蛋白有38個(FC≥2.0,P≤0.05)，上調表達量最高的蛋白為茶足柄瘤蚜繭蜂knottin樣蛋白(序列ID為Cluster-35028.0,FC=4.616)；下調表達蛋白有97個(FC≤0.50,P≤0.05)，下調表達量最高的蛋白為大蜜蜂Apisdorsata不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) M-like (序列ID為Cluster-50256.0,FC=0.145)?；鹕綀D(圖1)可以非常直觀地展現出滯育組與非滯育組樣本間的差異蛋白，及其統(tǒng)計學顯著性(P值)和表達水平差異程度(FC)。

圖1 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹差異表達蛋白火山圖Fig. 1 Volcano plot of differentially expressed proteins (DEPs) in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes None: 表達差異不顯著的蛋白Proteins without significant expression difference; Up: 上調DEPs (Up-regulated DEPs); Dwon: 下調DEPs (Down-regulated DEPs). 圖2同The same forFig.2. 橫坐標表示滯育蛹(D)與非滯育蛹(ND)間差異蛋白的差異倍數(log2值)，縱軸表示P值(-log10值)。Transverse coordinate indicates the fold change (log2P-value) of DEPs in diapause pupae (D) and non-diapause pupae (ND), and longitudinal axis represents the P-value (-log10 value).

2.2 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達蛋白的GO富集分析

圖2中，GO注釋到的差異蛋白數目為90，分為生物學過程、細胞成分和分子功能3類，富集到154條條目，共有44個GO條目顯著富集；在生物學過程中參與有機物代謝過程的蛋白數最多，高分子代謝過程和蛋白質代謝過程次之；在細胞成分中與胞內細胞器和細胞質功能相關的蛋白數較多；在分子功能部分中參與結構分子活性和核糖體結構組成的蛋白質數量較多。與天冬氨酸轉運(aspartate transport)、L-谷氨酸轉運(L-glutamate transport)、膽堿脫氫酶活性(choline dehydrogenase activity)、膽堿生物合成甘氨酸甜菜堿(glycine betaine biosynthetic process from choline)等條目相關的蛋白質在滯育階段顯著上調表達。

圖2 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹間差異表達蛋白的GO功能富集Fig. 2 GO function enrichment of differentially expressed proteins in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes

2.3 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達蛋白的KEGG富集分析

KEGG注釋到64個差異蛋白，共富集到97條KEGG pathway，對富集通路進行顯著性分析發(fā)現，除與人類疾病相關的通路外，有3條途徑顯著富集到KEGG pathway上，分別是核糖體(ribosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和逆行內源性大麻素信號(retrograde endocannabinoid signaling)。而富集到這些條目及通路中的蛋白質與能量代謝及抗逆性有密切關系。根據富集結果，繪制富集到的KEGG通路的氣泡圖(圖3, 只展示top20的結果)。

圖3 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹與非滯育蛹差異表達蛋白KEGG富集氣泡圖Fig. 3 Scatter plot of KEGG enrichment of differentially expressed proteins (DEPs) in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes 圖中橫坐標軸為相應通路中DEPs的數目與鑒定出的總蛋白數目的比值，值越大，說明在該通路中DEPs富集程度越高;圓點的顏色代表超幾何檢驗的P值，值越小，說明檢驗的可靠性越大、越具統(tǒng)計學意義。點的大小代表相應通路中DEPs的數目，值越大，該通路內DEPs越多。The abscissa in theFigure is the ratio of the number of DEPs in the corresponding pathway to the number of total proteins identified. The larger the value is, the higher the concentration of DEPs in this pathway is. The color of dots represents the P-value of hypergeometric test. The smaller the value is, the more reliable and statistically significant the test is. The size of the dots represents the number of DEPs in the corresponding pathway. The larger the dot, the more DEPs in the pathway.

3 討論

近年來，發(fā)現了大量滯育關聯(lián)蛋白，并鑒定分析了一些蛋白。例如，Hao等(2012)對菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis進行了滯育研究，主要研究了過氧化物相關酶在其親代效應中的作用，結果顯示，親代的滯育蛹過氧化物酶活性升高，過氧化氫酶活性降低，但是在滯育子代的卵中過氧化物酶和過氧化氫酶的活性顯著提高，并以此推測在代際間過氧化氫具有進行信號傳導的作用；Colinet等(2012)利用2D-DIGE技術對滯育與非滯育翼蚜外繭蜂Praonvolucre的蛋白進行檢測，確定了221個差異表達顯著的蛋白，對這些蛋白利用質譜技術鑒定，最終鑒定出細胞骨架蛋白、ATP 結合蛋白、角質層類蛋白、應激蛋白、糖酵解、脂代謝、蛋白質代謝等重要代謝過程中的酶等；黃鳳霞等(2015)利用iTRAQ技術，對滯育與非滯育煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis進行蛋白檢測，在滯育階段發(fā)現278個蛋白上調表達。本研究中下調表達量最高的蛋白為大蜜蜂不均一核糖核蛋白 M-like(序列ID為Cluster-50256.0,FC=0.145)，該蛋白被用作轉錄調節(jié)劑，促進轉錄抑制(黃嘉等, 2004)。這些差異表達蛋白主要與糖代謝、脂代謝、蛋白質代謝等代謝過程及氨基酸轉運、能量產生與轉化，各種代謝酶等有關。能量代謝是滯育昆蟲成活的關鍵，滯育期間的營養(yǎng)儲備水平直接影響昆蟲的存活情況以及滯育后的發(fā)育和生殖(張倩等, 2019)。KEGG通路分析顯示，茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育相關蛋白在氧化磷酸化通路顯著上調。在有氧條件下，氧化磷酸化作用是需氧細胞生物生命活動的主要能量來源，在細胞內的有機分子經氧化分解形成CO2和H2O，并釋放出能量使ADP和Pi合成ATP(王鏡巖等, 2008)。其中有10個與能量產生及轉化有關的蛋白過表達。在本研究中發(fā)現的與茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關的蛋白質主要涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞基(復合物)、細胞色素bc1復合物亞基、ATP合酶ε亞基、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)等。

NADH脫氫酶催化由NADH至輔酶Q的電子傳遞過程，同時將電子由線粒體基質轉移至膜間隙。細胞色素bc1復合物是線粒體呼吸電子傳遞鏈中的核心元素，是催化從輔酶Q到細胞色素C的電子傳遞過程，同時將質子由線粒體基質泵至膜間隙。ATP合酶ε亞基，屬于ATP合酶F1組分。ATP合酶，又稱F0F1-ATP酶，在細胞內催化能源物質ATP的合成(王鏡巖等, 2008)。在茶足柄瘤蚜繭蜂呼吸作用過程中通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉換為跨膜質子(H+)梯差，之后質子流順質子梯差通過ATP合酶可以使ADP+Pi合成ATP。ε亞基有抑制酶水解ATP的活性，同時有堵塞H+通道，減少H+外泄的功能，這一功能保證了茶足柄瘤蚜繭蜂在滯育過程中ATP的順利合成(倪張林, 2001)。在環(huán)境脅迫條件下，能量需求增加，通過氧化磷酸化途徑，能量產生增加，從而為滯育期間的茶足柄瘤蚜繭蜂提供更多的能量和營養(yǎng)物質，推斷NADH脫氫酶、細胞色素bc1復合物、ATP合酶對茶足柄瘤蚜繭蜂的逆境生存和能量緩沖有積極作用。谷氨酸脫氫酶是調控機體碳、氮代謝相互交叉的重要酶，催化氧化脫氨基作用(oxidative deamination)，氨基酸脫氨基后形成的氨是有毒物質。絕大多數陸生動物將脫下的氨轉變?yōu)槟蛩嘏判?。在GO富集結果中顯示，與天冬氨酸轉運、L-谷氨酸轉運條目相關的蛋白在滯育過程中上調表達，而天冬氨酸(aspartic acid)和谷氨酸(L-glutamic acid)是尿素形成的關鍵。線粒體中的谷氨酸脫氫酶將谷氨酸的氨基脫下，為氨甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)的合成提供游離的氨；細胞質中的谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase)把谷氨酸的氨基轉移給草酰乙酸(oxaloacetic acid)，草酰乙酸再形成天冬氨酸進入尿素循環(huán)(urea cycle)，谷氨酸為循環(huán)間接提供第2個氨基(王鏡巖等, 2008)。同時谷氨酸脫氫酶在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹中上調表達，表明滯育蛹體內將有更多的氨進入尿素循環(huán)。這可能是由于滯育蛹新陳代謝較弱，從而抑制了氨基酸的合成，導致氨過剩的結果。此外，有研究報道，滯育型棉鈴蟲Helicoverpaarmigera幼蟲可能通過在體內積累大量尿素達到抵御低溫的作用(Zhangetal., 2013)，茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹也同樣可能利用尿素來提高其耐寒性。NADH產生于糖酵解(glycolysis)和細胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)，谷氨酸經過轉化后可生成檸檬酸循環(huán)中間物質2-氧戊二酸，說明茶足柄瘤蚜繭蜂滯育對檸檬酸循環(huán)產生了顯著影響。檸檬酸循環(huán)不僅為生命體提供能量，同時也是糖類、脂類和氨基酸三者之間互轉化的樞紐(Bergetal., 2002)。已有研究表明，檸檬酸循環(huán)在昆蟲滯育期間受到抑制(Michaud and Denlinger, 2007; Xuetal., 2012; 劉遙等, 2014; Luetal., 2014)，這與滯育期間代謝減弱相符合。茶足柄瘤蚜繭蜂在滯育期間代謝減弱，與正常發(fā)育的茶足柄瘤蚜繭蜂相比，產能必定減少，但機體仍需要熱能來抵御低溫。在低溫環(huán)境下，生物體產熱增加，散熱減少。而實驗證明，在滯育過程中，參與氧化磷酸化通路的蛋白上調表達，說明此過程中產生的一部分能量用作維持正常的生命活動，還有一部分產生的是熱能。自然界適應冷環(huán)境的動物，利用氧化磷酸化解偶聯(lián)的方式產生大量的熱。它們的脂肪組織中有一種褐色脂肪組織含有產熱素(thermogenin)又稱解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein),能構建一種被動質子通道，使質子流從內膜外流向基質而不經過F0F1復合體的F0通道而是又回到基質，結果產生熱而不形成ATP(王鏡巖等, 2008)。我們推測,滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂脂肪組織中可能也存在這種“解偶聯(lián)劑”，使得蟲體在氧化磷酸化過程中既能滿足生命活動所需的能量，又能保證足夠的熱量來抵御低溫環(huán)境。但滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂體內是否含有這樣的物質，我們需進一步探究。膽堿脫氫酶活性、膽堿生物合成甘氨酸甜菜堿條目相關蛋白在GO富集結果中顯著上調，膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase)可催化底物合成甘氨酸甜菜堿(glycine betain)，因此甘氨酸甜菜堿的含量在滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中必然增加。在滯育條件下，茶足柄瘤蚜繭蜂受到水分脅迫，甜菜堿作為有機滲透劑可維持細胞滲透壓，同時甜菜堿對酶有保護作用，不僅可以抵御冰凍脅迫，對有氧呼吸和能量代謝過程也有良好的保護作用。

綜上所述，本研究從蛋白質組整體層面闡明茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育背后的多蛋白調控，重點篩選了與能量代謝相關的滯育關聯(lián)蛋白并分析了其功能，有助于更好地理解茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育的代謝機制，進一步擴展了對蚜繭蜂滯育機制的理解，為基于遺傳或化學調控天敵滯育建立提供了新思路、新平臺，具有重要的理論意義以及潛在的應用價值。