陳秀敏 劉族志 林建能

儋州市人民醫(yī)院口腔科，儋州 571799

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一種常見的口腔惡性腫瘤，近年來OSCC的治療取得了很大的進(jìn)展，但其致死率仍然居高不下[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一種內(nèi)源性、非編碼小分子RNA，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程，在OSCC的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[2]。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，miR-1290在OSCC患者中異常表達(dá)，能通過調(diào)控多種信號通路參與OSCC的發(fā)生發(fā)展，并可能成為治療OSCC的一個新靶點(diǎn)。本研究通過檢測OSCC患者血漿miR-1290表達(dá)水平，分析其表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為OSCC患者的預(yù)后預(yù)測及靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月1日—2018年12月31日儋州市人民醫(yī)院收治的OSCC患者70例，其中男性46例，女性24例，年齡38～73歲，平均年齡（57.40±8.26）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實為原發(fā)性O(shè)SCC患者；2）初次確診，且臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）病例資料不完整者；2）術(shù)前已行放療、化療或生物免疫治療者；3）術(shù)前有感染性疾病、自身免疫性疾病及合并其他惡性腫瘤者。另選取同期來儋州市人民醫(yī)院健康體檢的正常者40例作為對照組，其中男性26例，女性14例，年齡40～72歲，平均年齡（56.80±8.15）歲。2組性別、年齡及體質(zhì)指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 方法

采用前瞻性研究方法，通過電話或門診等方式對70例OSCC患者進(jìn)行隨訪，隨訪起始于術(shù)后第1天，截止時間為2019年10月31日。隨診間隔時間為3個月。總生存時間定義為術(shù)后第1天至患者死亡的時間。無進(jìn)展生存時間定義為術(shù)后第1天起，未發(fā)生復(fù)發(fā)、原發(fā)器官腫瘤轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時間。納入本研究的變量包括患者年齡、性別、吸煙情況、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑、腫瘤位置及淋巴轉(zhuǎn)移等情況。

1.3 血漿miR-1290檢測

所有的患者均于術(shù)前抽取空腹靜脈血3 mL置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，離心分離血漿，-80 ℃低溫冰箱保存待測。以U6為實驗內(nèi)參在ABI 7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國）上進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：1 μL引物及探針Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μL無核酸酶的水。擴(kuò)增條件為：95 ℃10 min 1個循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s進(jìn)行45個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-1290的表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有連續(xù)變量均通過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。單因素生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法，組間比較行Log-rank檢驗，多因素生存分析應(yīng)用COX回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組和對照組血漿miR-1290表達(dá)水平比較

OSCC組血漿miR-1290表達(dá)水平（0.65±0.14）明顯低于對照組（2.06±0.90），二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.912，P＜0.001）。

2.2 血漿miR-1290用于診斷OSCC的最佳界值

血漿miR-1290用于診斷OSCC的最佳界值為1.14，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.895（95%CI：0.837～0.958），其敏感度和特異度為89.2%和85.0%。

2.3 血漿miR-1290表達(dá)水平與OSCC患者的臨床病理特征比較

以miR-1290=1.14為界值，將70例OSCC患者分為高miR-1290組（miR-1290≥1.14，n=31）和低miR-1290組（miR-1290＜1.14，n=39）。高miR-1290組與低miR-1290組臨床分期、分化程度、腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。2組的性別、年齡、吸煙、飲酒情況及腫瘤位置相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.4 血漿miR-1290表達(dá)水平與OSCC患者預(yù)后不良的關(guān)系

70例OSCC患者中有2例失訪，隨訪率為97.1%（68/70），隨訪時間9～65個月，中位隨訪時間29.50個月。生存分析顯示，低miR-1290組患者（42.8%）的總生存率明顯低于高miR-1290組（63.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank χ2=9.715，P＜0.01）（圖1）。低miR-1290組患者（24.6%）無進(jìn)展生存率明顯低于高miR-1290組（53.7%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=12.805，P＜0.01）（圖2）。將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素調(diào)入COX回歸分析模型，結(jié)果顯示臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血漿miR-1290＜1.14是影響OSCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素[危險度（hazard，HR）（95%CI）=2.402（1.806～4.520）、2.627（1.984～5.940）、2.738（2.152～6.117）]（表2）。

表1 血漿miR-1290表達(dá)水平與OSCC患者的臨床病理特征比較Tab 1 Comparison of the expression level of plasma miR-1290 with the clinicopathological characteristics of OSCC patients

圖1 高miR-1290組與低miR-1290組OSCC患者總生存率比較Fig 1 Comparison of overall survival rate of OSCC patients in high and low miR-1290 groups

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，與靶mRNA分子結(jié)合后可以使mRNA降解并抑制蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中起重要作用[4]。有研究[5-6]表明，miRNA在OSCC組織和血液中存在異常表達(dá)，不同種類的miRNA通過不同調(diào)控機(jī)制來發(fā)揮功能，在口腔癌的進(jìn)展過程中miRNA的表達(dá)水平隨之變化，有望作為OSCC診斷和預(yù)后的重要生物學(xué)評價指標(biāo)。

圖2 高miR-1290組與低miR-1290組OSCC患者無進(jìn)展生存率比較Fig 2 Comparison of progression-free survival rate of OSCC patients in high and low miR-1290 groups

Schneider等[7]研究認(rèn)為，多種miRNA在OSCC中異常表達(dá)，其通過抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤的非依賴性生長、遷移及侵襲等，對OSCC的惡性生物學(xué)行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-1290調(diào)控癌基因作用包括兩方面：當(dāng)激活癌基因時，可引起癌基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過量表達(dá)，促進(jìn)癌變過程；當(dāng)抑制癌基因時，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的，其異常表達(dá)參與了信號激活、細(xì)胞增殖和分化、血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，可以作為肝癌和食管鱗癌診斷及預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物[8-9]。因此，研究miR-1290在OSCC患者中的表達(dá)情況，對OSCC預(yù)后判斷及靶向治療具有重要的意義。

表2 影響OSCC患者預(yù)后不良的單因素及多因素COX回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate COX regression analysis of poor prognosis in OSCC patients

本研究顯示，OSCC組血漿miR-1290表達(dá)明顯低于對照組，提示miR-1290可能具有抑癌基因的作用，其表達(dá)下調(diào)可能參與OSCC的發(fā)生發(fā)展。本研究隨著臨床分期增加、分化程度越來越差及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者，血漿miR-1290表達(dá)水平均明顯降低，說明miR-1290低表達(dá)與OSCC患者較差的臨床病理特征有關(guān)，miR-1290在OSCC中發(fā)揮抑癌基因功能，其低表達(dá)可導(dǎo)致一系列靶向的癌基因過度激活，從而參與OSCC的發(fā)生發(fā)展。Chen等[10]研究顯示，與正常對照組相比，OSCC患者血清miR-99a表達(dá)明顯降低，低miR-99a表達(dá)的OSCC患者更常出現(xiàn)分化不良和臨床晚期，其總體生存期較短，可能是預(yù)測OSCC患者預(yù)后的一個有價值的標(biāo)志物。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，OSCC患者血清miR-9表達(dá)水平明顯下降，且與多種臨床病理參數(shù)如臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可作為預(yù)測OSCC患者病情進(jìn)展和預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究進(jìn)一步探討miR-1290對OSCC患者預(yù)后的臨床價值，并分析OSCC患者miR-1290表達(dá)水平與生存時間之間的關(guān)系，結(jié)果顯示低miR-1290組患者總生存率和無進(jìn)展生存率明顯低于高miR-1290組，說明miR-1290低表達(dá)與OSCC患者生存期短有關(guān)。本研究多因素COX回歸模型分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血漿miR-1290＜1.14是影響OSCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，其中miR-1290＜1.14的HR（2.738，95%CI：2.152～6.117）最大，提示miR-1290＜1.14預(yù)測OSCC患者預(yù)后不良具有較高的價值。Shi等[12]通過多變量分析發(fā)現(xiàn)，miRNA是預(yù)測OSCC患者生存的獨(dú)立因素，與傳統(tǒng)的臨床病理因素如病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期相比，具有更高的預(yù)測價值，并可能作為一個有前途的預(yù)后預(yù)測因子。另有研究[13]表明，血漿miRNA表達(dá)下調(diào)與OSCC患者的臨床特征及與術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，有望作為預(yù)測OSCC患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。

綜上所述，OSCC患者血漿miR-1290表達(dá)水平明顯降低，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血漿miR-1290＜1.14是影響OSCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，miR-1290可能是預(yù)測OSCC預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物。但這些研究仍處于初步探索階段，未來仍需更多的多中心、大樣本的臨床研究來進(jìn)一步探討。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。