張松柏，張 勛，許 文，徐 偉，黃澤豪，林 羽，陳抒云 （福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

金 線 蓮Anoectochilus roburghii(Wall.) Lindl，又名金線蘭、金蠶、烏人參、金線入骨消等，是一種多年生蘭科草本植物[1]，主產地為福建。文獻報道多糖類、黃酮類、生物堿類、氨基酸類等是金線蓮主要化學成分[2]。其中金線蓮多糖是其主要藥理活性物質，具有降血糖、抗氧化、抗肝損傷、增強免疫功能、抗腫瘤等藥用功效[3]。本研究為提高金線蓮多糖提取率，采用超聲提取的方法，在單因素實驗的基礎上以響應面法優(yōu)化其提取工藝。蛋白質的存在往往影響到多糖的活性，蛋白的脫除是多糖提取純化的一個關鍵步驟[4]，且天然植物中多糖與蛋白質兩種高分子成分分子量相近，嚴重制約了進一步的分析[5]，而Sevage 試劑法、三氯乙酸（TCA）法、鹽法（氯化鈣和氯化鈉法）、鹽酸法等是多糖脫蛋白的常用方法[4-6]，為此，筆者對以上方法在金線蓮多糖提取中的影響進行了考察，為進一步深入研究金線蓮多糖奠定一定的基礎。

1 材料

1.1 儀器

UV-3 200 紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；AR224CN 電子天平（美國奧豪斯儀器常州有限公司）；HWS-12 型電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SC-04 低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

福建永泰產金線蓮樣品經福建中醫(yī)藥大學藥學院黃澤豪副教授鑒定為蘭科開唇蘭屬的金線蓮Anoectochilus roburghii(Wall.) Lindl。D-水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506）；乙醇（批號：20181208）、苯酚（批號：P815401）、氫氧化鈉（批號：20160509）購自上海國藥集團化學試劑有限公司；硫酸（批號：1706191）、鹽酸（批號：1903301，）、氯化鈉（批號：1610141）、氯仿（批號：1803121）購自廣東西隴科學股份有限公司；氯化鈣（廣東光華化學有限公司，批號：20091031）；正丁醇（江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20130418）；超純水（實驗室制備）。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

取D-葡萄糖50 mg 溶于1 000 ml 的量瓶中，加水定容，得對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取金線蓮鮮品清洗干凈，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，打粉，過60 目篩，得金線蓮干品。取金線蓮粉末5 g，以料液比為1：10 加水，48 ℃超聲提取30 min，超聲功率為300 W，超聲提取2 次；對上述提取液3 600 r /min 離心15 min，棄去沉淀，即得金線蓮原始液。取上述原始液5 ml 加4 倍體積無水乙醇放置過夜，4 000 r/min 下離心10 min，沉淀加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得供試品溶液。

2.3 金線蓮多糖含量

按本課題先前研究的“優(yōu)化的苯酚硫酸法”[7]，計算金線蓮多糖提取得率。

2.4 單因素實驗

按“2.2”項下的方法，對超聲提取工藝中各單因素進行考察：①以超聲溫度30、40、50、60、70、80 ℃分別進行提?。虎谝猿暪β?00、250、300、350、400 W 分別進行提??；③用超聲分別提取10、20、30、40、50 min；④以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30 的料液比加水；⑤用超聲分別提取1、2、3 次。

2.5 響應面法優(yōu)化超聲提取工藝

在單因素考察的基礎上，利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 中Box-Behnken 試驗原理，選擇對多糖提取率影響較大3 個因素料液比（A）、超聲提取時間（B）、超聲溫度（C）為自變量，以多糖提取率（R）為響應值，設計3 因素3 水平實驗。因素與水平設計如表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

2.6 脫蛋白方法的考察

2.6.1 鹽酸法脫蛋白[4,6]

取5 ml 金線蓮原始液，用2 mol/L 鹽酸調節(jié)至pH 3，并保持過夜。將該混合物在4 000 r/min下離心10 min，棄去沉淀，上清液加入4 倍體積無水乙醇放置過夜，4 000 r/min 下離心10 min，所得沉淀物加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得脫蛋白供試品溶液。

2.6.2 NaOH-CaCl2法脫蛋白[5]

取5 ml 金線蓮原始液，以2% NaOH 溶液將其調至pH 8～9，加熱至85 ℃。將CaCl2固體調至5%（50 g/L）的濃度，煮沸30 min，冷卻至室溫并過濾，用稀鹽酸將濾液調至pH 7，加入4 倍體積無水乙醇放置過夜，4 000 r/min 下離心10 min，得多糖沉淀。加水溶解重復上述操作3 次，所得沉淀物加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得脫蛋白供試品溶液。

2.6.3 NaOH-NaCl 法脫蛋白[5]

取5 ml 金線蓮原始液，在沸騰(90 ℃)條件下，用2%NaOH 溶液將多糖溶液調節(jié)到pH 9～10。加入NaCl 固體，濃度調至5%（50 g/L），然后混合煮沸30 min。冷卻至室溫并過濾，上清液用稀鹽酸調至pH 7。添加4 倍體積無水乙醇放置過夜沉淀多糖，在4 000 r/min 下離心10 min，棄上清液得多糖沉淀。加水溶解重復上述操作3 次，所得沉淀物加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得脫蛋白供試品溶液。

2.6.4 三氯乙酸（TCA）法脫蛋白[5]

取5 ml 金線蓮原始液，加入10% TCA 溶液將其調節(jié)到pH 3，靜置過夜。樣品4 000 r/min 離心10 min，沉淀物丟棄，上清液加4 倍體積無水乙醇放置過夜，在4 000 r/min 下離心10 min，棄去上清液得多糖沉淀。加水溶解重復上述操作3 次，所得沉淀物加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得脫蛋白供試品溶液。

2.6.5 Sevage 法脫蛋白[6]

取5 ml 金線蓮原始液，以金線蓮水提溶液：正丁醇：氯仿按1：1：4 的比例進行除蛋白，振蕩器振蕩20 min 后，4 000 r/min 轉速離心 5 min，棄去下層有機相。該過程重復3 次，上層水相添加4 倍體積無水乙醇放置過夜，在4 000 r/min 下離心10 min，棄去上清液得多糖沉淀物，所得沉淀物加水溶解，于1 000 ml 的量瓶中定容，得脫蛋白供試品溶液。

2.7 多糖損失率與蛋白脫除率

以“紫外分光光度法”對蛋白含量進行測定[5],

蛋白質濃度C(mg/ml) = 1.45A280-0.74A260

多糖損失率=[(供試品多糖含量－脫蛋白供試品多糖含量)/供試品多糖含量]×100%

蛋白脫除率=[(供試品蛋白含量－脫蛋白供試品蛋白含量)/供試品蛋白含量]×100%

3 實驗結果

3.1 不同方法提取金線蓮多糖

參考相關文獻，按“2.2” 項下使用不同提取方法制得對應的供試品，比較多糖得率，結果如表2。

表2 提取金線蓮多糖方法比較

實驗結果表明，超聲提取和酶提取均能獲得較高的多糖提取率，由于酶價格昂貴，超聲提取操作簡便，且能獲得高提取率，故選擇超聲提取進行下一步研究。

3.2 單因素實驗結果

如圖1 所示：①隨著提取溫度的增加，提取得率逐漸增加，在50 ℃提取得率達到最大值，后隨著溫度的增加提取率逐漸下降并趨于穩(wěn)定，故初步確定提取溫度40～60℃作為進一步響應面考察設計的水平；②在超聲功率為300 W 時多糖提取率最高，實驗結果顯示，隨著超聲功率的增加，多糖提取率先上升后下降，但影響相對較小，故選定功率為300 W 進行下一步分析；③以超聲提取30 min，提取率最高，故初步確定超聲時間20～40 min 作為進一步響應面考察設計的水平；④料液比為1∶10 時，多糖提取率最高，隨著料液比的增加，提取率稍有下降且趨于平穩(wěn)，故初步確定料液比1∶5～1∶15 作為進一步響應面考察設計的水平；⑤隨著提取次數(shù)的增加，提取率逐漸降低，提取3 次后，多糖已基本提取完全，考慮實際操作及原料等，選定提取2 次進行下一步分析。

3.3 響應面法優(yōu)化超聲提取工藝

在單因素考察的基礎上，利用軟件Design-Expert. V 8.0.6.1 中Box-Behnken 試驗原理，設計3 因素3 水平實驗。響應值設計方案及結果見表3，方差分析見表4。對數(shù)據分析后得到回歸方程為：

多糖提取率(R)=13.08+0.026A+0.50B+0.25C+0.085AB+1.05AC-0.56BC-1.05A2-0.47B2-0.49C2。

由表3 知，回歸模型有很好的顯著性（P＜ 0.000 1），說明二項式方程擬合良好，模型二項式方程失擬項不顯著（P=0.246 3），說明未知因素對實驗干擾較小，擬合的相關系數(shù)r=0.992 6，模型可信度良好，故可運用此模型實現(xiàn)超聲提取金線蓮多糖最佳工藝的分析探究。

根據擬合方程繪制響應面圖譜，響應面分析的等高線圖和響應面圖（圖2、圖3），AC、BC 具有相互影響，各圖為料液比（A）、超聲時間（B）、超聲提取溫度（C）中任意一個變量取零水平，其余變量對金線蓮多糖提取率的交互作用影響。由圖2、圖3可以看出，提取時間對提取率影響最為顯著，三者的主效應關系為：提取時間(B)＞提取溫度(A)＞料液比（C），其中料液比與提取溫度的響應曲面最為陡峭，證明料液比與提取溫度的交互作用最為強。

通過Design-Expert. V 8.0.6.1 軟件對二項式回歸方程進行最優(yōu)值的計算，確定理論上的多糖提取最佳工藝：料液比為1∶9.88，超聲提取溫度為48.76 ℃，超聲提取時間為36.08 min，超聲提取次數(shù)為2 次，超聲功率為300 W，其多糖提取的理論得率為13.22%，考慮到實際操作的可行性，最佳工藝定為料液比1∶10，超聲提取溫度48 ℃，超聲提取時間36 min，超聲提取次數(shù)為2 次，超聲功率為300 W。為驗證實驗結果，進行3 組平行實驗，多糖提取得率分別為13.14%、13.05%、13.20%，其RSD為0.57%，提取得率的均值13.13%與理論值13.22%偏差0.09%，表明優(yōu)化后的提取工藝可行，適用于金線蓮中多糖的提取。

表3 Box-Behnken 試驗設計方案及結果

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結果

3.4 脫蛋白方法的比較

按“2.6”項下的方法進行脫蛋白操作，得出多糖損失率及蛋白脫除率結果如表5。實驗結果表明，NaOH-CaCl2法脫蛋白可以獲得較高蛋白脫除率，同時也能獲得最低的多糖損失率。

表5 不同脫蛋白方法對金線蓮多糖損失及蛋白脫除的考察結果(n=3)

4 結論與討論

植物多糖的提取方法包括了超聲提取法[8]、酶法[9]、回流提取[9]、傳統(tǒng)溫水浸提[10]等，傳統(tǒng)熱水浸提與回流提取的提取效率低，且操作煩瑣，考慮到酶法中由于酶價格昂貴，不適用于批量金線蓮多糖的提取，本文采用超聲提取的方法，操作簡單，且以響應面優(yōu)化后的提取工藝能夠取得較高得率。因金線蓮多糖中所含蛋白對進一步分析產生影響[6]，所以，本研究考察了5 種除蛋白的方法，結果表明NaOH-CaCl2法最佳，既能獲得較高蛋白脫除率，同時多糖損失最少；本研究將兩者結合，實現(xiàn)了對金線蓮多糖成分的最大化提取與保留，為金線蓮多糖的深度開發(fā)提供了參考。