段春燕，何娜娜，朱 蕾，范 磊，伊 凡，王 婷，鄧皖利

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 烏魯木齊 830016；2. 新疆昌吉州中醫(yī)醫(yī)院 昌吉 831100；3. 青島西海岸新區(qū)中心醫(yī)院 青島 266555；4. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院 烏魯木齊 830000；5. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 200120）

結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，高居腫瘤相關(guān)死亡率第二位，結(jié)直腸癌在國內(nèi)外的發(fā)病率仍持續(xù)上升[1-2]。隨著早期診斷和治療手段的發(fā)展和改進(jìn)，結(jié)直腸癌的切除率和生存率有所提高，整體中位生存期現(xiàn)已延長至30個月[3-4]?；熓侵型砥诮Y(jié)直腸癌、術(shù)后患者甚至術(shù)前的重要治療手段，但迄今為止的化療方案均未達(dá)到預(yù)期效果[5]，尋找探索新型化療藥物對于改善結(jié)腸癌預(yù)后具有重要意義。近年來，研究證明可食植物肉豆蔻具有抗癌的藥理作用，肉豆蔻中提取的肉豆蔻醚（myristicin）是發(fā)揮抗腫瘤作用的重要有效活性成分[6-7]。有研究顯示，肉豆蔻醚可以抑制多種惡性腫瘤如肺癌[8]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9]等生長。本課題以結(jié)腸癌HCT116 和LOVO 細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象，檢測肉豆蔻醚對HCT116 和LOVO 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步探討其中分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

研究的細(xì)胞為人結(jié)腸癌HCT116 和LOVO 細(xì)胞，購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 藥物

所用的藥物為肉豆蔻醚（百靈威科技有限公司，貨號：607-91-0）。

1.3 主要試劑和儀器

主要試劑和儀器為：1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（上海源培生物有限公司，貨號：L220）；胎牛血清（Thermo Fisher-USA，貨號：10100147）；0.25%胰蛋白酶（上海源培生物有限公司，貨號：S330JV）；青鏈霉素混合液（Thermo Fisher-USA，貨號：15070063）；MTT（Sangon Biotech-Shanghai，貨號：298-93-1）；DMSO（Sigma-USA，貨號：D5879）；EDTA(100X)（BBI Life Sciences，貨 號：E673003-0100）；1M Tris pH7.4（Beyotime，貨 號：ST788）；30% Acr/Bis（Beyotime，貨號：ST003，）；APS（生工生物工程股份有限公司，貨號：7727-54-0）TEMED（上海歌凡生物科技有限公司，貨號：WB012）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific，貨號：26616）；a-Tublin 抗體（上海拓然生物科技有限公司，貨號：66031-1-lg）；ERK 抗體（CST，貨號：4696）；p-ERK 抗體（Santa Cruz，貨號：sc-7383）；CyclinD1（上海拓然生物科技有限公司，貨號：60186-1-lg）；p-MEK1/2（CST，貨號：166F8）；MEK1/2（CST，貨號：9122）；E-cadherin（Abcam，貨號：ab1416）；MMP-2（CST，貨號：4022）；MMP-9（CST，貨號：3852）；發(fā)光液（愛必信生物科技有限公司，貨號：abs921）；多聚甲醛（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，貨號：30525-89-4）；結(jié)晶紫（生工生物工程股份有限公司，貨號：548-62-9）；Transwell 小室（BD，貨號：353097）；Annexin V/PI 檢測試劑盒（BBI Life Science，貨 號：E606336-0100）；流 式 細(xì) 胞 儀（BD Bioscience，貨號：FACS Calibur）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，貨號：DYCZ-25E）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，貨號：DYCZ-40G）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠，貨號：XDS-1）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，貨號：RT-6100）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT116 和LOVO 細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，采用含10%新生牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)傳代，待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用來做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

將對數(shù)生長期的HCT116 和LOVO 細(xì)胞以5000 cells/well 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種體積為0.1 mL。待細(xì)胞貼壁后，將不同濃度的肉豆蔻醚（2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL和80 μg/mL）加入對應(yīng)的孔中，每個用藥濃度設(shè)置6個復(fù)孔，空白對照組加等體積的配藥溶劑。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，向每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO 溶解MTT的還原產(chǎn)物甲瓚，震動混勻數(shù)秒，用酶標(biāo)儀檢測，以570 nm 為參照波長測定其吸光度。計算腫瘤細(xì)胞的存活率，利用Graph Pad prism 軟件計算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。半數(shù)抑制濃度（IC50）代表細(xì)胞存活率達(dá)到一半時的藥物作用濃度。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

將HCT116 和LOVO 細(xì)胞消化計數(shù)，以每孔2 ×105cell/well 的密度接種于6 孔板，設(shè)置不同的肉豆蔻醚濃度（0 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL），分別加入對應(yīng)的孔板中，藥物處理48h，收集細(xì)胞，PBS 重懸清洗細(xì)胞2次，用1 × binding buffer 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1 × 105個/mL。取100 μl 的細(xì)胞懸液至各個EP 管中，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL 的PI 進(jìn)行染色，充分混勻后，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1 × binding buffer，上機(jī)檢測藥物作用后細(xì)胞凋亡的改變。按照流式細(xì)胞儀的說明操作儀器進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果中四個象限代表的意義分別是：左下象限：正?；罴?xì)胞群；右下象限：處于早期凋亡的細(xì)胞群；右上象限：處于晚期凋亡的細(xì)胞群；左上象限：壞死的細(xì)胞群。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況

在6 孔板背面用marker 筆沿直尺畫直線，使直線穿過整個孔，以上述方法每孔穿過4條線，每條線之間間 隔0.5 mm。將2 μg/mL、5 μg/mL 處 理48 h 的HCT116 和LOVO 細(xì)胞接種于6 孔板。鏡下觀察細(xì)胞劃痕，并用Leica QwinV3軟件測量劃痕距離，根據(jù)劃痕距離計算細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移的距離公式：（Oh劃痕寬度減去24 h 劃痕寬度）/2。移行距離抑制率定義為:（d對照組減去d用藥組）/d對照組×100%。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲情況

提前一天將Matrigel 從-20℃冰箱取出，在4℃冰上過夜凍融。實(shí)驗(yàn)中所需的槍頭，移液管及EP 管提前一天在4℃進(jìn)行預(yù)冷。用無血清培養(yǎng)基1640 將Matrigel以1：3比例進(jìn)行稀釋，混勻后鋪于Transwell小室上層。待接種細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基稀釋配制，加入已鋪膠的Transwell 小室內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入配好 的 不 同 濃 度 的 肉 豆 蔻 醚（2 μg/mL、5 μg/mL）。Transwell 小室的下層加入400 μL 含5% FBS 的培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將Transwell 上室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，用棉簽輕柔的擦拭小室膜的上層，去除未遷移的細(xì)胞及Matrigel 基質(zhì)膠。接下來用4%甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，室溫放置15 min。用蒸餾水輕柔的洗Transwell 小室3-5 次，洗去染色劑。鏡下觀察并計數(shù)穿過Matrigel 膜的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞侵襲率計算公式為：（1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)）×100%。

圖1 MTT檢測肉豆蔻醚對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和LOVO增殖的影響

圖2 檢測肉豆蔻醚對HCT116和LOVO細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肉豆蔻醚對HCT116和LOVO細(xì)胞凋亡的影響

1.9 Western blot

采 用Western blot 實(shí) 驗(yàn) 檢 測MEK1/2、ERK1/2、CyclinD1、E-cadherin、MMP-2 以及MMP-9 表達(dá)水平變化。在0 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL 肉豆蔻醚作用48 h后，消化收集細(xì)胞，采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用Bradford 法檢測蛋白含量。然后將蛋白樣品在95°C 水浴中變性并與上樣緩沖液混合加到SDS-PAGE 膠上，每個孔蛋白上樣量保持一致。隨后陸續(xù)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL發(fā)光、顯影、定影。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

文中數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。t檢驗(yàn)（ttest）和單因素方差分析（One-way ANOVA）用于推測統(tǒng)計。P＜0.05 代表數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)差異。每個實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

圖4 WB實(shí)驗(yàn)檢測肉豆蔻醚對MEK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的影響

2.1 肉豆蔻醚在體外抑制HCT116和LOVO細(xì)胞增殖

MTT 結(jié)果顯示肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 細(xì)胞48 h 后，各濃度組對細(xì)胞增殖均有抑制作用，與對照組比較均有差異（P＜0.05），并且肉豆蔻醚對細(xì)胞增殖的抑制作用呈顯著的劑量依賴性（圖1A、B）。根據(jù)抑制率計算藥物作用后的IC50值分別為23.68、21.17。

2.2 肉豆蔻醚抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和LOVO 的遷移和侵襲

劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 細(xì)胞48 h 后，能夠抑制細(xì)胞的遷移。隨著藥物濃度的增加，抑制細(xì)胞遷移作用增強(qiáng)（圖2A）。

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肉豆蔻醚作用結(jié)腸癌細(xì)胞48 h 后，能有效抑制細(xì)胞的侵襲。隨著藥物濃度的增加，穿過Matrigel 凝膠到達(dá)小室下層的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，對侵襲作用的抑制能力逐漸增強(qiáng)（圖2B）。

2.3 肉豆蔻醚誘導(dǎo)HCT116和LOVO細(xì)胞凋亡

Annexin V/PI 雙染法結(jié)果顯示，當(dāng)肉豆蔻醚作用HCT116和LOVO細(xì)胞48 h后，活細(xì)胞數(shù)目百分比由多變少；凋亡細(xì)胞數(shù)目百分比由少變多，說明肉豆蔻醚對HCT116 和LOVO 細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，并且該誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性（圖3 A和B）。

2.4 肉豆蔻醚調(diào)控MEK/ERK信號通路表達(dá)

當(dāng)肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 細(xì)胞48 h 后，經(jīng)Western blot 法 檢 測 細(xì) 胞 中MEK1/2、ERK1/2、CyclinD1、E-cadherin、MMP-2 以及MMP-9 表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，肉豆蔻醚能升高細(xì)胞中E-cad表達(dá)，能降低細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)（圖4）。

3 討論

中醫(yī)藥在治療腫瘤中發(fā)揮著十分重要的作用，并且在抑制腫瘤的增殖方面也占據(jù)關(guān)鍵地位。中醫(yī)治療從整體而論，扶正與祛邪并重。放療與化療主要是對腫瘤的抑制作用，以攻為主。但中醫(yī)的治療中正邪兼顧，虛則補(bǔ)之，實(shí)則瀉之，攻補(bǔ)兼施。不但兼顧了患者因疾病導(dǎo)致的虛，同時也對腫瘤部位進(jìn)行攻伐，兩者相得益彰[10-11]。近年來，對中醫(yī)藥抗腫瘤的研究越來越多，許杜娟等[12]研究表明黃芪提取物可以增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫力、抑制細(xì)胞的生長，從而加強(qiáng)小鼠的抗腫瘤能力。李建軍等[13]研究靈芝多糖對荷瘤小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖干預(yù)后的小鼠T細(xì)胞明顯升高，說明靈芝多糖可以增強(qiáng)小鼠免疫力、抑制腫瘤的生長。中醫(yī)在腫瘤治療中極具特色，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制與中醫(yī)理論相結(jié)合，從現(xiàn)代研究中闡述中醫(yī)藥抗腫瘤的機(jī)理，對于腫瘤的防治有重要的意義。

肉豆蔻屬于肉豆蔻科，早在《本草綱目》卷十四《草部·肉豆落》中對其釋名：“（寇）宗爽曰：肉豆落對草豆落為名。去殼只用肉。其形圓小，皮紫緊薄，中肉辛辣?！毙詼匚缎痢＞哂欣砥⒃餄?，行氣調(diào)中，澀腸止瀉，溫中行氣的作用。入脾、胃、大腸經(jīng)，能夠起到溫中、下氣、消食、固腸等作用。常被用于治療心腹脹痛、虛瀉冷痢、嘔吐、宿食不消等癥。肉豆蔻中的主要成分為揮發(fā)油、脂肪油、苯丙素和木脂素等。肉豆蔻醚是采用乙醇提取的主要成分，被認(rèn)為具有抗癌活性[14]。研究顯示，肉豆蔻醚作用于荷瘤小鼠后，可抑制腫瘤的生長，并能有效的提高小鼠免疫力，提示肉豆蔻通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功從而達(dá)到抗腫瘤的效果[15]。

ERK是MAPK家族中重要的成員之一[16]。ERK家族共有5個亞族，包括ERK1～ERK5，在ERK 家族中研究最廣泛的是ERK1和ERK2，這兩個分子廣泛表達(dá)在多種細(xì)胞中，參與細(xì)胞內(nèi)很多生理過程的調(diào)節(jié)[17]。在正常生理狀態(tài)下，ERK1/ERK2 通路對腸上皮細(xì)胞增生、分化中具有促進(jìn)作用，并且能夠抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡；當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)異常時，比如腫瘤的發(fā)生，氧化應(yīng)激等，這些均會刺激細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（Ras），Ras 進(jìn)一步激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Raf蛋白激酶），活化的Raf-1 蛋白酶可以與MEK1、MEK2結(jié)合，使MEK1、MEK2 發(fā)生磷酸化，磷酸化的MEK 再激活下游的ERK1/2，使其磷酸化，即ERK 的活性形式，后者進(jìn)入細(xì)胞核，作用于各種轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)基下游因表達(dá)[18]。該通路發(fā)生異?；罨A(yù)示著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)較為活躍，腫瘤細(xì)胞增殖速度加快，較易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，對化療、放療的敏感性降低，患者生存時間縮短等[19]。MEK/ERK 信號通路在調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡中起著重要作用，其中CyclinD1 是細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)因子，當(dāng)MEK/ERK 信號通路被激活后，CyclinD1表達(dá)水平升高，加快了細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，肉豆蔻醚能夠明顯下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、CyclinD1 表達(dá)水平。提示肉豆蔻醚可能通過調(diào)控MEK/ERK 信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是由多環(huán)節(jié)構(gòu)成，層層遞進(jìn)，涉及多步驟、多方面。其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是始動環(huán)節(jié)。EMT 主要參與生物胚胎發(fā)育、器官纖維化以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。EMT的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力的改變有相關(guān)性。EMT最顯著的特征之一就是E-cad表達(dá)水平的降低，E-cad 具有維持細(xì)胞間粘附的功能，其表達(dá)水平的降低或缺失會降低細(xì)胞間黏附，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，且易于發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移[21]?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs），是一種能夠降解細(xì)胞基底膜的蛋白酶，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[22]。當(dāng)腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時，常伴有Ecad表達(dá)降低而MMP-2，MMP-9表達(dá)升高[23]。因此，上調(diào)E-cad表達(dá)或下調(diào)MMP-2，MMP-9表達(dá)可抑制結(jié)腸癌的遷移侵襲。本實(shí)驗(yàn)采用western blot 方法檢測肉豆蔻醚對細(xì)胞E-cad、MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示肉豆蔻醚能夠上調(diào)HCT116 細(xì)胞E-cad 表達(dá)，同時能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9 的表達(dá)。以上結(jié)果表明肉豆蔻醚可能通過調(diào)控EMT 來抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究證實(shí)肉豆蔻醚可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116 和LOVO 細(xì)胞增殖、遷移侵襲，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且初步說明肉豆蔻醚可能通過調(diào)控MEK/ERK 信號通路以及EMT過程而發(fā)揮以上的抗癌活性。本研究結(jié)果為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)和策略。