唐加峰，張 滔，，黃世瑩，杜玉梅，李 靜，冉建華，陳地龍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶 400016；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120；重慶醫(yī)科大學(xué) 3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究中心、4.公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016)

黑色素瘤(melanoma)是一種最具侵襲性的皮膚癌，具有死亡率高、轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差等特點(diǎn)，其5年生存率僅為6%，中位生存期約為6～8個(gè)月[1]。黑色素瘤的治療方式主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫治療等等[2]。黑色素瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性低，原因是其產(chǎn)生的黑色素可削弱射線的殺傷作用[3]，因此黑色素瘤的治療效果不盡如人意。由于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤幾乎對(duì)大多數(shù)當(dāng)前療法完全耐藥，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)[4]，因此進(jìn)一步尋找新的藥物和治療方式顯得至關(guān)重要。

高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)是從三尖杉屬的枝葉中提取出來(lái)的生物堿，分子式為C29H39NO9，分子量為545.6[5]，目前臨床上主要用于急性粒細(xì)胞白血病的治療，對(duì)于急性單核細(xì)胞白血病及惡性淋巴瘤也有一定療效。最新研究證明，HHT在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)出良好的抑制作用，如肺癌、直結(jié)腸癌和乳腺癌[6]等，而HHT對(duì)黑色素瘤的作用效果卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究的主要內(nèi)容是用HHT處理人黑色素瘤A375細(xì)胞，評(píng)估其作用效果，篩選出最佳作用濃度和時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與增殖相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)探究HHT潛在的作用機(jī)制，期待能為黑色素瘤的治療提供新的思路和手段。

1 材料

1.1 細(xì)胞株A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥物與試劑HHT(純度：99.96%，貨號(hào)：HY-14944)和Cell Counting Kit-8(CCK-8，貨號(hào)：HY-K0301)購(gòu)自MCE公司；南美胎牛血清(10270-106,Gibco)和高糖培養(yǎng)基DMEM(C11995500BT,Gibco)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、青-鏈霉素、Hoechst 33258染液和PMSF均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；凝膠配置試劑盒、雙色預(yù)染蛋白Marker和無(wú)蛋白快速封閉液均購(gòu)自雅酶生物；一抗抗體CDK1、Cyclin B1、Bax、Bcl-2、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase 3和GAPDH購(gòu)自Bimake(Houston,TX,USA)；二抗抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 儀器低溫高速離心機(jī)(平凡儀器，TGL-185)；M450酶標(biāo)測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng)、Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；DMi8倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇A375細(xì)胞，將其置于含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 藥物配置按照試劑商的說(shuō)明書提供的方法，稱取1 mg HHT，將其溶解在1.832 8 mL二甲基亞砜(DMSO)中，配制成1 mmol·L-1的藥品儲(chǔ)存液，分裝后保存于-80 ℃冰箱中。后期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用DMEM稀釋藥品儲(chǔ)存液。

2.3 CCK-8法檢測(cè)A375細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL。該實(shí)驗(yàn)分為3組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組：不含細(xì)胞和HHT，僅加入DMEM完全培養(yǎng)基；對(duì)照組：含細(xì)胞不含HHT；實(shí)驗(yàn)組：含細(xì)胞和不同濃度的HHT(濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·L-1)。在培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8工作液，再將96孔板放入孵箱孵育1.5 h。孵育完成后，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率/%=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對(duì)照組-A空白對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Hoechst 33258 染色實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A375細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于24孔板中，每孔1 mL。將實(shí)驗(yàn)分兩組，對(duì)照組：接種細(xì)胞不加藥處理；HHT組：接種細(xì)胞并給藥處理(0.4 μmol·L-1)。在孵箱中培養(yǎng)24 h后，取出24孔板，去除培養(yǎng)基，加入固定液固定，用PBS洗掉固定液。加入適量的Hoechst 33258染色液，并充分覆蓋住細(xì)胞樣品，室溫避光染色5 min，棄染色液，用PBS洗滌3次后，用熒光顯微鏡觀察拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A375細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量并調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，向不同組別的細(xì)胞中分別加入含終濃度0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1HHT處理24 h。移除培養(yǎng)液，并加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4 d更換一次培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的集落形成(約14 d)便終止培養(yǎng)。移除培養(yǎng)液，用PBS清洗后，加入4%多聚甲醛固定液固定15 min，吸除多聚甲醛，用PBS洗掉固定液后加入結(jié)晶紫染色液染5 min，用自來(lái)水洗去多余的染色液，拍照并用ImageJ統(tǒng)計(jì)每孔克隆形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于6孔板中，每孔3 mL。該實(shí)驗(yàn)分為2組，對(duì)照組：接種細(xì)胞沒(méi)有加藥處理并常規(guī)培養(yǎng)；HHT組：給予含終濃度為0.4 μmol·L-1的HHT完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基并用PBS洗滌2次，離心收集各組細(xì)胞，按照Annexin V-熒光素(FTIC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以5×107·L-1的密度接種于6孔板各孔中，每孔3 mL。該實(shí)驗(yàn)分為2組，對(duì)照組：已接種細(xì)胞沒(méi)有加藥處理并常規(guī)培養(yǎng)；HHT組：給予含終濃度為0.4 μmol·L-1的HHT完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基并用PBS洗滌2次，離心收集各組細(xì)胞，用提前預(yù)冷75%乙醇固定過(guò)夜，用PI試劑染色，PBS清洗2次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)將A375細(xì)胞分為4組，分別加入不同濃度(0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1)的HHT，處理24小時(shí)后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定不同組別的蛋白濃度。將4組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用無(wú)蛋白快速封閉液在室溫條件下封閉半小時(shí)，加入一抗(Bax，Bcl-2，Cleaved-caspase 3，Cleaved-PARP，Cyclin B1，CDK1和GAPDH，稀釋比例均為1 ∶1 000)置于4度孵育過(guò)夜。使用TBST清洗3遍硝酸纖維素膜，加入與一抗對(duì)應(yīng)的二抗(以1 ∶10 000的比例稀釋)在室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，最后使用ECL系統(tǒng)對(duì)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次。

3 結(jié)果

3.1 HHT抑制A375細(xì)胞的增殖CCK-8結(jié)果顯示，用不同濃度的HHT作用于A375細(xì)胞24、48和72 h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖受到抑制，差異明顯(P<0.01)。并隨著藥物的劑量和作用時(shí)間增加，HHT對(duì)A375細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。計(jì)算24小時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為0.4 μmol·L-1，因此選擇該濃度作為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究的最大濃度，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effect of HHT on proliferation of A375 cells by CCK-8 **P<0.01 vs control

3.2 HHT促進(jìn)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡A375細(xì)胞經(jīng)0.4 μmol·L-1HHT誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行Hoechst33258染色，染色結(jié)果如Fig 2所示，對(duì)照組的細(xì)胞核形態(tài)完整呈橢圓形，熒光強(qiáng)度均一，凋亡細(xì)胞少；而HHT處理組可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為核濃縮、核碎裂、核邊集等特征，證明該組細(xì)胞發(fā)生了凋亡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如Fig 3所示，用0.4 μmol·L-1的HHT處理A375細(xì)胞48 h后，HHT組的A375細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 2 Homoharringtonine induced A375 cells for 24 h by Hoechst 33258 staining(×400)

Fig 3 Effect of HHT on apoptosis of A375 cells by **P<0.01 vs control

3.3 HHT誘導(dǎo)A375細(xì)胞周期阻滯于G2/M期用0.4 μmol·L-1的HHT處理A375細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HHT組G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，而G0/G1和S期細(xì)胞比例減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示0.4 μmol·L-1的HHT可使A375細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Effect of HHT on cell cycle distribution of A375 cells by **P<0.01 vs Control

3.4 HHT降低A375細(xì)胞的克隆形成能力克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同濃度HHT(0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1)處理A375細(xì)胞后，克隆形成能力受到明顯抑制，且隨著藥物濃度增高，細(xì)胞集落形成數(shù)明顯減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 5。

Fig 5 Effect of HHT on colony-formation **P<0.01 vs control

3.5 Western blot檢測(cè)A375細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)用不同濃度的HHT(0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1)作用于A375細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示，HHT組Bcl-2的蛋白水平均明顯下調(diào)，而B(niǎo)ax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-PARP蛋白水平升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6。結(jié)果提示了HHT可以誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Fig 6 Effect of HHT on expression of Bax,Bcl-2,Cleaved PARP and Cleaved caspase-3 protein in A375 **P<0.01 vs control

3.6 Western blot檢測(cè)A375細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)用不同濃度的HHT(0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1)作用于A375細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示，HHT組中與細(xì)胞周期相關(guān)的 CDK1和Cyclin B1蛋白表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 7。蛋白水平的結(jié)果證實(shí)了HHT可以誘導(dǎo)A375細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。

Fig 7 Effect of HHT on CDK1 and Cyclin B1 protein expression in A375 **P<0.01 vs control

4 討論

黑色素瘤是一種侵襲性極高的惡性腫瘤，在腫瘤早期階段便可發(fā)生轉(zhuǎn)移，晚期患者預(yù)后極差[7]，一旦確診多屬于晚期，因而黑色素瘤死亡率逐年增高。目前黑色素瘤的治療方案較為單一，臨床上主要以手術(shù)切除為主，放療及化療為輔助治療手段。而化療療效欠佳，不良反應(yīng)較大，并且容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥[8]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤治療領(lǐng)域取得了一些新的進(jìn)展，如人參皂苷、吳茱萸堿和白藜蘆醇[9]等。因此，探索中藥對(duì)黑色素瘤的療效，或許是提高其預(yù)后的新思路。

20世紀(jì)70年代初，HHT得到分離與鑒別，由于其對(duì)白血病臨床效果顯著，2012年FDA批準(zhǔn)了HHT用于治療白血病。根據(jù)目前的研究結(jié)果，HHT可以與核糖體60S亞基的A位點(diǎn)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制氨?；?tRNAs的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成，這種抑制作用具有劑量和時(shí)間的相關(guān)性[10]。HHT還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)上調(diào)Bax促凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)Caspace-3、Caspace-9和PARP的活化，引起人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。本研究采用CCK-8法檢測(cè)HHT對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明HHT對(duì)A375細(xì)胞有較好的抑制作用，且藥物的作用濃度較低，表現(xiàn)為時(shí)間和濃度依賴性。同時(shí)，HHT還可以抑制A375細(xì)胞的克隆形成能力，濃度越高集落形成數(shù)越少。以上結(jié)果均證實(shí)了HHT可以有效的抑制A375的增殖。

Bcl-2是一種線粒體外膜蛋白，它能夠抑制有促凋亡作用的細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[12]。Bax是存在于高級(jí)真核生物中的核編碼蛋白，它們能夠刺穿線粒體外膜以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其過(guò)表達(dá)可拮抗Bcl-2的作用，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，主要有兩種途徑：一個(gè)是死亡受體途徑，另一個(gè)是線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[14]。細(xì)胞色素C的釋放是線粒體凋亡途徑激活的顯著特征。線粒體外膜的透化作用導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結(jié)合，導(dǎo)致Caspase-9和Caspase-3激活而引起細(xì)胞凋亡[15]。而活化的capspase-3裂解PARP，后者被認(rèn)為是凋亡的標(biāo)志物。

本研究采用HHT作用于A375細(xì)胞，用Hoechst33258和FCM檢測(cè)結(jié)果證明了HHT誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western blot結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-PARP表達(dá)增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，具有濃度依耐性。因此，HHT可能是通過(guò)改變Bax和Bcl-2在細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Cleaved-caspase 3和Cleaved-PARP表達(dá)增高證明了HHT可能激活了A375的線粒體凋亡途徑。

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是細(xì)胞正常生命過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)，只有通過(guò)檢查點(diǎn)，細(xì)胞才能正常進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期[16]。CDK1/Cyclin B復(fù)合體是G2/M期檢查點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)G2/M期時(shí)，該復(fù)合物被大量合成，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯時(shí)，CDK1/Cyclin B復(fù)合體的含量相應(yīng)降低[17]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，HHT處理A375細(xì)胞后，CDK1和Cyclin B1的蛋白水平降低，同時(shí)FCM的結(jié)果也說(shuō)明HHT可以使A375細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯。以上結(jié)果表明，HHT可降低CDK1和Cyclin B的水平，從而降低CDK1/Cyclin B復(fù)合物的含量，導(dǎo)致A375細(xì)胞停滯在G2/M期，從而抑制A375細(xì)胞增殖。

綜上所述，HHT對(duì)A375細(xì)胞有良好的抗腫瘤活性，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可能是一種治療黑色素瘤的有效藥物。其機(jī)制可能是HHT通過(guò)激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，上調(diào)Bax和Caspase-3，最終活化PARP，引起A375細(xì)胞凋亡；下調(diào)CDK1和Cyclin B1的表達(dá)，引起A375細(xì)胞周期的阻滯。接下來(lái)，我們將更進(jìn)一步探索HHT在體內(nèi)的作用效果以及分子機(jī)制。