閆云靜，王 帥，穆云萍，賴姨梅，李芳紅

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，江西 贛南 341000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是源于子宮內(nèi)膜上皮的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性腫瘤中位于第六位[1]。如能早期診斷，子宮內(nèi)膜癌病人具有良好的預(yù)后結(jié)果，但仍有15%～25%患者就診時已是晚期，診斷晚期或復(fù)發(fā)病例的中位生存時間不超過1年[2]。因此，對于EC的篩查、診斷以及治療的分子新靶點及機(jī)制的研究尚有許多問題有待解決。

FK506結(jié)合蛋白38(FK506-bindingprotein 38，F(xiàn)KBP38)作為免疫親和素的一員，與癌癥發(fā)生可能有密切關(guān)系。FKBP38是哺乳動物的雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycin，mTOR)內(nèi)源性抑制劑，可通過與mTOR 相結(jié)合來抑制mTOR的下游通路[3]。研究表明[4]，在高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞4T1及黑色素瘤細(xì)胞B16-F10中，F(xiàn)KBP38發(fā)揮著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP38蛋白與多種癌癥發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性[5-6]，進(jìn)一步表明FKBP38蛋白可能在抑制癌細(xì)胞增殖活性或抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用。

本研究首次檢測了不同分級、不同分期子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38蛋白表達(dá)水平變化，并通過在細(xì)胞水平過表達(dá)FKBP38研究其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca的影響。為進(jìn)一步探討FKBP38對于癌癥的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及病毒 人源子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa(Grade 1)，RL95-2,Hec-1-A，Hec-1-B(Grade 2),AN3Ca (Grade 3) 均購美國細(xì)胞研究庫(American Type Culture Collection,ATCC)。FKBP38過表達(dá)慢病毒載體購自廣州賽業(yè)公司，慢病毒載體為LV-EF1a>hFKBP38 [NM-012181.4]-CMV>eGFP/T2A/Puro 和LV-CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分別標(biāo)為FKBP38及Vector)。慢病毒中包括FKBP38全長cDNA，所有結(jié)構(gòu)都經(jīng)DNA測序驗證，轉(zhuǎn)染效果經(jīng)實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)及免疫印跡(Western blot)驗證。

1.1.2試劑 RPMI1640(Lot:1976019)，DMEM(Lot:2105326)，DMEM-F12(1973914)，McCoy’s 5A(Lot:SLBN4158V)，胎牛血清和胰酶(Lot:2120649)均購自美國Gibco公司，E.Z.N.A.Total RNA KitⅠ購自美國OMEGA公司，ProteinK選自美國Sigma 公司，Power SYBR Green PCR Master Mix選自Vazyme公司。Pierce BCA Protein Assay Kit選自美國Thermo公司，引物由上海生工生物有限公司合成。FKBP38、蛋白激酶B( Protein kinase B,Akt)、核糖體蛋白S6( Ribosomalprotein S6，S6)抗體購自R&D 公司，真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,P-4E-BP1)、P-4E-BP1、p-Akt、P-S6抗體購自CST公司。Edu檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。Transparent PET Membrane 24 Well 8.0 μm pore size及 Invasion Chambers with 8.0 μm PET Membrane in two 24 Well Plates 購自美國Corning公司。

1.1.3儀器 AC2-4S1型二級生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica德國)；CMAXPLUS+酶標(biāo)儀(美國)；-80 ℃冰箱(中國美菱)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa細(xì)胞于RPMI 1640+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，RL95-2細(xì)胞于DMEM+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，Hec-1-A細(xì)胞于McCoy＇s 5A+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，Hec-1-B細(xì)胞于DMEM-F12+10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，AN3Ca細(xì)胞于MEM+10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細(xì)胞均于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)皿70%～80%進(jìn)行傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及感染 將AN3Ca細(xì)胞分為對照組(Vector)及過表達(dá)FKBP38組(FKBP38)，將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長于60%時進(jìn)行病毒感染實驗，收集細(xì)胞抽提RNA及蛋白進(jìn)行RT-PCR及Western blot檢驗病毒干擾效率。

1.2.3細(xì)胞mRNA水平檢測 將培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞利用E.Z.N.A.Total RNA Kit試劑盒提取RNA，再通過逆轉(zhuǎn)RNA得到cDNA，Vazyme公司的Power SYBR Green PCR Master Mix為體系對相應(yīng)的目的基因進(jìn)行進(jìn)行RT-RCR。FKBP38 上游引物：5′-TCCAGCGCCAAAGTG GACAT-3′,下游引物：5′-GAGCTCTGCGTGGATCG TCT-3′;β-actin上游引物:5′-GATTACTGCTCTGGC TCCTAGC-3′,下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTG CTTGC-3′。

1.2.4細(xì)胞蛋白水平檢測 取10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿加入100 μL添加有PMSF的RIPA裂解液，用無菌細(xì)胞刮刮下，于95 ℃金屬浴變性5 min，超聲破碎，12 000 r·min-1離心5 min取上清，將提取的蛋白用BCA測濃度，Western blot檢測各細(xì)胞中FKBP38表達(dá)。

1.2.55-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,Edu)檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1 000/孔的密度均勻加入96孔板,48 h后根據(jù)Edu檢測試劑盒說明書進(jìn)行Edu染色，熒光倒置顯微鏡檢測細(xì)胞染色情況并進(jìn)行拍照統(tǒng)計。

1.2.6平板克隆實驗 將AN3Ca細(xì)胞以600個/孔密度均勻鋪于35 mm培養(yǎng)皿，每孔加入2 mL培養(yǎng)基，放于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，10 d后去除上清，每孔加入800 μL 4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，無菌水洗3遍去除背景色，晾干統(tǒng)計形成克隆的數(shù)目，實驗重復(fù)3遍。

1.2.7Transwell小室實驗[7]取對數(shù)生長期細(xì)胞換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓10 h，10 h后制成細(xì)胞懸液。遷移實驗：細(xì)胞計數(shù)，AN3Ca細(xì)胞以1.5×105密度加入Tranwell 小室上室中，下室中加入800 μL含20%FBS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。侵襲實驗：將凍存于-20 ℃帶有Matrigel膠小室提前2 h放于37 ℃融化，細(xì)胞計數(shù)，AN3Ca細(xì)胞以2×105密度加入帶有基質(zhì)膠的小室上室中，下室中加入800 μL含20%FBS完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后取出上層小室，棄內(nèi)側(cè)廢液，用棉簽輕輕擦拭微孔膜內(nèi)側(cè)，PBS清洗內(nèi)側(cè)3遍，4%多聚甲醛固定150 min，結(jié)晶紫染色10 min，清洗，倒置晾干，于倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同病理分級子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38表達(dá)情況Realtime quantitative PCR(RT-qPCR)結(jié)果顯示(Fig 1A)，與病理分級較低Ishikawa細(xì)胞相比，Hec-1-A、Hec-1-B、RL95-2及AN3Ca病理分級較高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38 mRNA表達(dá)較低，對比Ishikawa細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。此外，Western blot檢測FKBP38蛋白的結(jié)果顯示相同趨勢(Fig 1B)。實驗表明不同病理分級子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38表達(dá)不同，并且隨著病理分級的增加，F(xiàn)KBP38表達(dá)量降低。

Fig 1 FKBP38 expression in each group of five human endometrial cancer cellsA：The mRNA expression in five endometrial cancer cell lines Protein levels in five endometrial cancercell lines.**P<0.01 vs Ishikawa

2.2 穩(wěn)定過表達(dá)FKBP38的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株的建立利用攜帶FKBP38的病毒感染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca。隨后，我們利用RT-qPCR手段檢測FKBP38的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(Fig 2)，與對照病毒感染組相比，F(xiàn)KBP38過表達(dá)病毒使AN3Ca細(xì)胞中FKBP38的mRNA水平升高(P<0.01)。Western blot檢測兩組中FKBP38蛋白的結(jié)果與RT-qPCR分析的結(jié)果相符，即在AN3Ca細(xì)胞中感染過表達(dá)FKBP38病毒后，F(xiàn)KBP38蛋白水平上調(diào)。以上結(jié)果表明穩(wěn)定過表達(dá)FKBP38的AN3Ca細(xì)胞株構(gòu)建成功。

Fig 2 FKBP38 expression in vector and FKBP38 overexpression groupsA：The mRNA expression in Vector and FKBP38 ；B：Protein levels in Vector and FKBP38.**P<0.01 vs vector

2.3 FKBP38對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖能力影響Edu實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FKBP38后AN3Ca細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01)(Fig 3)，結(jié)果表明，過表達(dá)FKBP38可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca體外增殖活力。

Fig 3 Effect of FKBP38 over expression on cell proliferation of AN3Ca vs vector

平板克隆實驗可檢測細(xì)胞增殖能力及群體依賴性。Fig 4實驗結(jié)果顯示，與Vector相比，AN3Ca細(xì)胞過表達(dá)FKBP38后細(xì)胞克隆的數(shù)目明顯減少(P<0.01)。實驗進(jìn)一步表明FKBP38可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca的增殖能力。

Fig 4 Effect of FKBP38 over expression on plate colony assay of AN3Ca cells n=3)**P<0.01 vs vector

2.4 FKBP38對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲能力影響通過(無/有)基質(zhì)膠的Transwell小室檢測過表達(dá)FKBP38后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca的遷移及侵襲能力變化，F(xiàn)ig 5結(jié)果顯示，過表達(dá)FKBP38后細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞個數(shù)顯著減少(P<0.01)。以上實驗表明，F(xiàn)KBP38可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca的遷移及侵襲能力。

Fig 5 Effect of FKBP38 over expressionon migration(A) andinvasion (B) of AN3Ca cells n=3)**P<0.01 vs vector

2.5 FKBP38過表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CAmTOR通路影響通過Western blot檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA過表達(dá)FKBP38對mTOR通路的影響，結(jié)果表明，細(xì)胞過表達(dá)FKBP38后P-S6、P-4E-BP1、4E-BP1蛋白無明顯變化，但S6總蛋白表達(dá)增加(Fig 6)。這提示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可能存在反饋系統(tǒng)，在細(xì)胞S6相對磷酸化水平降低時通過過表達(dá)S6總蛋白來增加P-S6含量。此外，過表達(dá)FKBP38蛋白可降低Akt蛋白磷酸化水平，說明FKBP38蛋白可能是通過調(diào)控Akt磷酸化水平來調(diào)控信號通路。

Fig 6 Effect of FKBP38 over expression on mTOR pathway of AN3Ca cells

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，其死亡率僅次于宮頸癌[1]。子宮內(nèi)膜癌的治療主要是通過手術(shù)切除子宮、卵巢、輸卵管或輔以化療。為更好評估子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)個體疾病行為并最終改善治療決策和結(jié)果，領(lǐng)域內(nèi)專家已提出將分子特征與子宮內(nèi)膜癌分類及風(fēng)險評估結(jié)合起來[8]。其中包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyli-nositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK 等信號通路。其中mTOR通路為關(guān)鍵性通路之一。mTOR是細(xì)胞生長增殖的中心調(diào)控分子。mTOR存在兩種生化和功能不同的復(fù)合物，mTORC1和mTORC2，其中mTORC1通過作用于底物核糖體S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1)和4E-BP1的磷酸化水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖。mTORC2可通過磷酸化Akt來調(diào)控Akt的活性[9]。

mTOR通路在多種腫瘤類型(包括子宮內(nèi)膜癌)的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素可協(xié)同抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa的增殖[11]，臨床研究表明，mTOR抑制劑在子宮內(nèi)膜癌中表現(xiàn)出臨床活性，抑制mTOR通路可能是一個可行的治療靶點[12]。前期的文獻(xiàn)報道中已經(jīng)證明，F(xiàn)KBP38蛋白是通過結(jié)合Rheb1從而成為mTOR內(nèi)源性抑制劑，也可與mTOR以類似FKBP12-mTOR結(jié)合方式結(jié)合從而抑制mTOR的活性[9]。另外，F(xiàn)KBP38為線粒體膜蛋白，可招募BCL-2至線粒體上抑制凋亡[13]。FKBP38在多種癌組織中均有不同程度的下調(diào)，說明FKBP38可能在抑制癌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用[6]。此外Sylvia Fong等[4]發(fā)現(xiàn)FKBP38可抑制乳腺癌細(xì)胞4T1 及黑色素瘤細(xì)胞B16-F10轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步表明FKBP38可能與癌細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移相關(guān)。

為研究FKBP38對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響，本實驗檢測了不同分級的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38表達(dá)水平,并通過過表達(dá)FKBP38來檢測其對于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同病理分級，不同分期子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FKBP38表達(dá)不同，隨著病理分級升高FKBP38表達(dá)水平逐漸降低。為研究不同病理分級子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞FKBP38的表達(dá)，我們選取了5株不同病理分級的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞進(jìn)行研究。為進(jìn)一步研究FKBP38對于子宮內(nèi)膜癌的影響，我們選取FKBP38表達(dá)量顯著降低的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，AN3Ca，來過表達(dá)FKBP38檢測其表型變化。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca中過表達(dá)FKBP38后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活力顯著降低，說明FKBP38可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著抑制細(xì)胞增殖的作用。雖然這可能與前期研究中FKBP38可招募Bcl-2至線粒體抑制凋亡作用相矛盾，但Huang等[14]指出，死亡的腫瘤細(xì)胞可利用凋亡過程產(chǎn)生強(qiáng)有力的生長刺激信號，以刺激腫瘤細(xì)胞的再生，表明某一基因可能同時存在增強(qiáng)細(xì)胞增殖及凋亡的作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)FKBP38可有效抑制AN3Ca細(xì)胞的遷移及侵襲能力。為研究FKBP38對于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca細(xì)胞的作用機(jī)理，我們檢測mTORC1的直接下游底物，通過驗證S6和4EBP-1 的磷酸化水平來間接地驗證mTOR 的激活水平，此外，我們還檢測mTOR的重要調(diào)控靶點Akt的磷酸化水平。

綜上表明，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3Ca過表達(dá)FKBP38后，mTOR下游基因S6磷酸化水平對比對照組無明顯變化，但S6總蛋白表達(dá)增加，這提示我們子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可能存在反饋系統(tǒng)，在細(xì)胞S6相對磷酸化水平降低時通過過表達(dá)S6總蛋白來增加P-S6含量。4E-BP-1磷酸化水平無明顯變化，提示我們在子宮內(nèi)膜癌中FKBP38可能未通過調(diào)節(jié)4E-BP-1蛋白表達(dá)來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲等生理活動。此外，Akt的磷酸化水平降低，表明過表達(dá)FKBP38蛋白可降低Akt蛋白磷酸化水平。但是FKBP38下調(diào)Akt的信號通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。