李春蘭(武威職業(yè)學(xué)院，甘肅 武威 733000)

0 引言

分子印跡技術(shù)與人工合成分子識別系統(tǒng)和生物識別系統(tǒng)具有一定的相似性，通過對分子印跡聚合物進(jìn)行制備，從而可以實現(xiàn)分子鍵合強(qiáng)度和選擇特異性。分子印跡聚合物在藥物分離分析、固相萃取等方面得到廣泛的應(yīng)用。

1 分子印跡的原理及方法

分子印跡技術(shù)是將目標(biāo)分子作為模板通過功能匹配的方式，結(jié)合共價非共價與模板分子的共同結(jié)合，形成單一模板復(fù)合物復(fù)合物。在交聯(lián)劑的作用下，可以產(chǎn)生聚合反應(yīng)，聚合物可以洗去模板分子，與模板分子的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，形成特異性特征，使分子產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附性。

1.1 共價印跡法

模板分子與功能單體從過結(jié)合的方式，形成結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的分子，但是此類方法制備過程比較復(fù)雜，模板分子很難脫離出來。回收利用的環(huán)節(jié)中，很難達(dá)到熱力學(xué)平衡。

1.2 非共價印跡法

此類方法與共價印跡方法相比，模板分子與功能單體通過氫鍵和疏水的作用下形成共價鍵的結(jié)合。氫鍵應(yīng)用非常多，其合成方法非常簡單，操作方式更加靈活。氫鍵的作用形成比較弱，因此模板分子非常容易清洗與脫落，提升其適用性。然而其結(jié)合位點作用強(qiáng)度存在一定的差異，導(dǎo)致非特異性吸附產(chǎn)生。

1.3 準(zhǔn)共價印跡法

準(zhǔn)共價印跡法是將共價法與非共價法結(jié)合起來，通過模板分子與功能單體的結(jié)合，形成選擇性強(qiáng)的方法，這種方法的適用性非常廣泛。

1.4 金屬離子印跡法

金屬離子印跡法主要采用氧原子和鈉原子配位的方式形成電子分子，復(fù)合物的穩(wěn)定性非常高。

2 分子印跡技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

2.1 手性拆分

在手性分子分離技術(shù)進(jìn)行研究中，主要分析消旋體的生物活性。與傳統(tǒng)的色譜法比較來說，分子印跡技術(shù)可以有效的避免手性固相法價格高昂、容易污染的局限性，而且分子印跡技術(shù)的手性流動相選擇比較小。

2.2 分子印跡傳感器

分子印跡傳感器具有非常強(qiáng)的選擇性，并且靈敏度高，在藥物分析中得到廣泛應(yīng)用。結(jié)合模板分子，將鄰氨基酚作為功能單體，從而制作印跡膜電化學(xué)傳感器。

2.3 表面印跡聚合應(yīng)用

2.3.1 材料

掃描電鏡(99.9%)購自遠(yuǎn)野(上海)有限公司，偶氮二異丁腈(AIBN)。亞甲基琥珀酸是從天津天力化學(xué)試劑有限公司獲得的。乙烯二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、甲基丙烯酸(MAA)、辣根過氧化物酶(HRP)由Sigma Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)提供。氯化鉀、醋酸鈉、醋酸和氫氧化鈉均購自國家集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

2.3.2 溶劑

磷酸鹽緩沖鹽(PBS)-0.1M磷酸鹽緩沖鹽(pH7.4)。

PBS-T-含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液。

TMB基質(zhì)溶液-在250μL二甲基亞砜中添加3.3mg TMB到25mL含3.25μL 30%H2O2溶液的檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH4.3)中。

1.25M H2SO4溶液。

2.3.3 實驗中用到的設(shè)備

采用使用掃描電子顯微鏡(日本東京日立高科技公司)觀察MIP的表面形貌。采用傅立葉變換紅外光譜法(FTIR)，用多光譜微型板分光光度計(美國加州熱科學(xué)儀器有限公司)、SHA-B恒溫振蕩器(上海武友有限公司)測定免疫測定吸光度。

2.3.4 計算模型

利用Gaussian 09軟件開發(fā)了基于DFT和交換相關(guān)函數(shù)(M062X)的計算建模方法，用于計算掃描電鏡與不同功能單體之間的結(jié)合能(ΔE)。分析了SEM與不同功能單體配合物的三維結(jié)構(gòu)、鍵長和鍵角。根據(jù)公式(1)計算ΔE：

式中：Ec為絡(luò)合物的能量；Et和Em分別為模板和單體的勢能。

2.3.5 溶液體系中模板分子和功能單體的光譜分析

以甲醇-乙腈(1:1，v/v)為溶劑，模板分子SEMs與功能MAA單體的比例分別為1:0、1:2、1:4、1:6和1:8。將混合溶液在恒溫水浴中振蕩12h，以相應(yīng)濃度的功能性單體溶液為參考，測定其紫外吸收光譜，并研究其波長位移。

甲醇-乙腈(1:1，v/v)用作溶劑。制備20mM SEM溶液和200mM MAA溶液，按5:2比例混合，以甲醇/乙腈(1:1，v/v)為對照進(jìn)行FTIR分析和比較。通過分析SEM與MAA鍵合前后光譜中基團(tuán)拉伸振動峰的變化，可以判斷SEM與MAA鍵合反應(yīng)。

2.3.6 MIP膜的制備

MIP的制備環(huán)節(jié)中，首先，將0.2mmol的掃描電鏡和0.8mmol的甲基丙烯酸甲酯分別置于16mL乙腈/甲醇(1:1，v/v)中，37℃磁力攪拌1h，依次加入2.4mmol的EGDMA和20mg的AIBN，37℃磁力攪拌1h，將混合液加入96孔微量滴定板中，200μL/孔，將微量滴定板置于密封的容器中充滿氮?dú)獾拇?，?7℃下聚合24h。

聚合后，在甲醇-醋酸洗脫液(9:1，v/v)中超聲洗脫微量板，每2h更換一次洗脫液，直到不再含有SEM(12h)。然后將微量滴定板在甲醇溶液中洗滌2h以除去醋酸，并在37℃干燥2h。作為對照，NIP(非分子印跡聚合物)的制備與MIP相同，但沒有SEM。

用掃描電子顯微鏡觀察MIP和NIP的表面形貌，比較兩者的差異，掃描電子顯微鏡的步驟如下：將樣品(100μg)用導(dǎo)電膠帶固定在圓柱形支架上，然后在10kV的加速電壓下進(jìn)行真空鍍金。在觀察之前，樣品在10mA下用金濺射30s。觀察時間應(yīng)盡可能短，以避免電子束長期照射造成的電子損傷。

將不同濃度(10～100mg/L)的掃描電鏡標(biāo)準(zhǔn)溶液(200μL)加入制備的MIP微量滴定板的每個孔中。在25℃的搖瓶機(jī)上以500rpm搖板1h，用HPLC-MS/MS測定SEM濃度，根據(jù)吸附前后SEM濃度的變化，計算MIPs對SEM的吸附能力。作為對照，NIP處理與MIP相同。

將掃描電鏡溶液(20mg/L)以200μL/孔的速度加入到MIP微量滴定板中。將微量滴定板置于25℃的軌道振動篩上，在25℃下振動(500r/min)不同時間(5、10、20、30、40、50、60、80和100min)。在不同時間，測定溶液中未吸附的掃描電鏡的含量。計算了MIP的吸附容量，并繪制了吸附動力學(xué)曲線。

吸附容量(Q)按式(2)計算：

式中：Q為吸附量(μg/孔)；C0為SEM的初始濃度(μg/mL)；C為吸附后上清液中SEM的濃度(μg/mL)；V為每孔加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)。

2.3.7 酶標(biāo)抗原的制備

將5mg HRP溶解在1mL去離子水中，然后添加0.2mL 0.1M NaIO4。將混合物在37℃下攪拌20min，滴入0.2mL乙二醇并攪拌30min。在4℃下用1M醋酸鈉緩沖液透析過夜后，添加2mL 5mg/mL掃描電鏡溶液，并將pH值調(diào)整至9.5。然后在黑暗中將混合物攪拌1h，添加0.1mL 4mg/mL NaBH4，在4℃下放置2h，并在0.1M PBS緩沖液(pH=7.4)中透析3d。加入等量的甘油，然后將制劑儲存在-20℃下，制備的藥物標(biāo)記抗原濃度為5mg/mL。

先將1g/L的掃描電鏡原液稀釋至不同濃度(10000、1000、100、10和1ng/mL)。將這些掃描電鏡標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到MIP微量滴定板(100μL/孔)中，并將1:800稀釋比(100μL/孔)的掃描電鏡-HRP溶液加入到同一孔中。同時建立對照井和空白井。以1:800稀釋比填充100μL PBST和100μL SEM HRP溶液，空白井填充200μL PBST。將微量滴定板放在滾動混合器上2min，在37℃下孵育1h，然后丟棄微量滴定板中的溶液，每3min用PBST清洗5次，并拍打在干凈的濾紙上干燥。

將制備好的底物溶液(150μL)添加到每個孔中，并在37℃下孵育30 min。然后將每個孔中的溶液轉(zhuǎn)移到新的微量滴定板的相應(yīng)孔中，并且通過每個孔添加50μL 1.25M H2SO4溶液來終止反應(yīng)。然后，在450nm處用多光譜微板分光光度計測定OD值。以SEM濃度為橫坐標(biāo)(x)，按公式計算相應(yīng)濃度的抑制率，以濃度為縱坐標(biāo)(y)繪制抑制濃度曲線。

2.3.8 樣品制備和方法驗證

使用大約2g藥品進(jìn)行均質(zhì)化，然后，將均勻的樣品裝入50mL離心管中，分別加入1、10和20μg/kg的掃描電鏡溶液，然后加入7.5mL去離子水和0.5mL 1M鹽酸。然后將該混合物徹底渦流混合30s，將pH值調(diào)整為7.5，渦流混合5min后，加入10mL乙酸乙酯。將混合物置于25℃下20min。然后，將樣品在2400g下于25℃下離心10min。收集乙酸乙酯層并在40℃下于氮?dú)饬飨赂稍?。?mL甲醇PBS溶液(1:1，v/v)將殘渣重組，在2400g下離心10min。收集下層進(jìn)行以下BELISA分析。

采用掃描電鏡(SEM)標(biāo)準(zhǔn)加入法，對BELISA法的準(zhǔn)確度和適用性進(jìn)行了評價。此外，我們采用傳統(tǒng)的ELISA和HPLCMS/MS方法對實際藥物樣品進(jìn)行了掃描電鏡分析，并與已有方法進(jìn)行了比較。

3 結(jié)語

近年來，分子印跡技術(shù)發(fā)展非常迅速，結(jié)合仿生傳感器和納米印跡技術(shù)，在藥物分析中得到廣泛的應(yīng)用。因此，在藥物分析中，應(yīng)該充分結(jié)合分子印跡技術(shù)的優(yōu)勢，有效的克服傳統(tǒng)手動印跡的局限性。