印邁 吳玉杰 蔡夢

摘要 ? ?檢測了一個具有紫黑色果肉的蘋果的ANR基因，發(fā)現(xiàn)了該基因被沉默。為了分析其沉默的原因，通過試驗分析了該啟動子序列上的順式作用元件、內(nèi)含子序列、外顯子序列等的變異。結果表明，其ANR基因沉默可能是由內(nèi)含子產(chǎn)生的變異引起，上述研究結果為今后的進一步研究打下了基礎。

關鍵詞 ? ?蘋果;ANR基因;內(nèi)含子;基因沉默

中圖分類號 ? ?S661.1 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）15-0057-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?The ANR gene of an apple with purple-black pulp was detected， and it was found that the gene was silenced. In order to analyze the causes of ANR gene silencing， the variations of cis-acting elements， intron sequences and exon sequences on the promoter sequence were experimentally studied. The results indicated that the ANR gene silencing may be caused by the variation produced by the intron. The above results laid a foundation for further research in the future.

Key words ? ?Malus domestica; ANR gene; intron; gene silencing

花青素還原酶（簡稱ANR酶）是花青素代謝途徑中的關鍵酶，隨著其在植物不同部位表現(xiàn)出不同的活性，使得果實以及花瓣呈現(xiàn)不同的顏色[1]。在ANR酶催化作用下，花青素會被轉(zhuǎn)化成原花青素（PA），而不會生成花青苷[2]。在擬南芥中過量表達ANR基因，會增加細胞中的原花青素含量、減少花青素含量[3-4]。研究ANR基因的表達調(diào)控將為通過基因工程改良植物的花青素合成性狀打下基礎，目前已經(jīng)有一些關于ANR基因研究的文獻報道[5-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，一個蘋果（Malus domestica）種質(zhì)材料的ANR基因不表達，擬通過本試驗尋找可能的原因。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

3種蘋果的嫩葉。

1.2 ? ?DNA的提取

采用北京艾德萊生物科技有限公司的DN14-植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA。

1.3 ? ?RNA的提取和cDNA的合成

采用北京艾德萊生物科技有限公司的RN53-多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒進行總RNA的提取，用同一公司的PC44-第一鏈60 ℃高溫反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.4 ? ?引物

用于檢測蘋果ANR基因mRNA（GenBank中的登錄號為XM_029110431.1，基因編號為LOC114827797）表達的上游引物序列為TCAACAAAAGATACCCCCAG，下游引物序列為GATAGCTAGCTCGATACATGC。用于PCR擴增涵蓋該ANR基因開放閱讀框區(qū)域基因組DNA的上游引物序列為TTCCGATTCGATTGGACG，下游引物序列為ACACGCCGCT GTTGCTTT。用于PCR擴增該ANR基因啟動子序列的上游引物序列為ATCTGTGCTGGGTTCTTCTT，下游引物序列為CTGACGGTGGTTCTGACG。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.5 ? ?測序

將PCR擴增得到的DNA產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取含目的條帶的凝膠，采用北京艾德萊生物科技有限公司的DR01-瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收DNA片段，送南京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 ? ?序列分析

采用DNAStar軟件進行DNA和mRNA序列的拼接和比對，在PLACE網(wǎng)站進行順式作用元件在線分析，網(wǎng)址為https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?cDNA的PCR擴增

對來源于3種不同蘋果的嫩葉cDNA樣品進行PCR擴增，然后將獲得的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示?？梢娍闯?，1號和2號蘋果嫩葉cDNA可以有效地擴增出DNA目的條帶，而3號蘋果嫩葉cDNA卻沒有擴增出相應的DNA條帶，表明該基因的mRNA在3號蘋果葉片中沒有成功轉(zhuǎn)錄。由于3號蘋果嫩葉cDNA樣品用其他引物能夠擴增出條帶，顯然cDNA樣品質(zhì)量沒有問題，剩下的可能原因就是此種蘋果材料的ANR基因發(fā)生了變異或其他原因。

2.2 ? ?3號蘋果ANR基因的基因組序列和啟動子序列的獲得

為了回答上述問題，提取了3號蘋果的基因組DNA，用一對引物PCR擴增ANR基因上游的啟動子序列和部分對應于mRNA的DNA序列，用另一對引物PCR擴增對應于ANR基因mRNA的DNA序列。引物設計時已經(jīng)考慮到2對引物PCR擴增獲得的2段序列要有1段重疊序列，因而在測序后將2段序列進行拼接，獲得了5 315 bp長度的DNA序列（圖2）。

2.3 ? ?mRNA檢測引物序列的比對分析

將mRNA檢測引物序列與上述獲得的DNA序列進行比對，結果表明，兩者100%同源。說明未從3號蘋果cDNA樣品PCR擴增到DNA條帶，不是由于對應的基因序列發(fā)生變異所引起。

2.4 ? ?啟動子序列和順式作用元件比較分析

取上述獲得的序列轉(zhuǎn)錄起始點A上游1 kb的DNA序列進行啟動子序列和順式作用元件比較分析。與NCBI數(shù)據(jù)庫中ANR基因（編號LOC114827797）啟動子相比，有23處發(fā)生了堿基替換，分別為836T/C、841C/A、973C/T、983C/T、1 015T/C、1 018T/C、1 047A/G、1 057C/T、1 070A/G、1 074C/T、1 106C/T、1 143A/G、1 164T/A、1 298G/A、1 331G/A、1 343A/T、1 462A/T、1 472G/A、1 554G/T、1 621A/T、1 680A/G、1 748T/A、1 801T/G;2處發(fā)生了缺失，分別為1 164～1 165缺失AA、1 766～1 767缺失T。

與NCBI數(shù)據(jù)庫中ANR基因（編號LOC114827797）啟動子相比，絕大多數(shù)的順式作用元件一致，缺少了5種順式作用元件和增加了1種順式作用元件（表1）。從這些增加和減少的順式作用元件的功能看，3號蘋果材料中相應的ANR基因不表達不太可能與啟動子的變異有關。

2.5 ? ?外顯子和內(nèi)含子序列變異分析

從外顯子和內(nèi)含子序列變異分析可見，第1外顯子有3處堿基發(fā)生了替換，第5外顯子有1處變異，其他外顯子沒有變異;第1內(nèi)含子有39處發(fā)生變異，第2～5內(nèi)含子都有不同數(shù)目的堿基變異（表2）。

外顯子的變異很少，內(nèi)含子的變異較多。mRNA序列上起始密碼子到終止密碼子長度為1 020 bp，對應的DNA區(qū)域的序列共有3處變異，翻譯成蛋白質(zhì)序列共有339個氨基酸殘基長度，其中僅有1個氨基酸由甲硫氨酸變異為纈氨酸，位于第21個氨基酸的位置。因此，內(nèi)含子的變異可能阻礙了相應ANR基因的轉(zhuǎn)錄。

3 ? ?結論與討論

外源DNA片段隨機插入基因的內(nèi)含子有時會影響mRNA的轉(zhuǎn)錄，內(nèi)含子自身產(chǎn)生變異也有可能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄。在本研究中觀察到3號蘋果材料ANR基因的5個內(nèi)含子均有不同程度的變異，ANR基因的沉默可能是由此引起。特別是第1內(nèi)含子變異最多，變異類型包括堿基替換、缺失和插入，但是由哪一個內(nèi)含子的變異引起了基因的沉默仍然需要進一步研究。突變的內(nèi)含子DNA片段是否能引起其他基因的沉默、如何引起沉默等，都值得進一步試驗研究。

Xie等[4]增強ANR基因在擬南芥中的表達，導致了細胞中花青素含量的下降，而原花青素的含量則上升[4]。李先良等[6]研究結果表明，具有紅色果實的芒果，其ANR基因表達量較低。嚴 ?娟等[7]研究認為，桃子果肉原花青素含量與ANR酶活性密切相關。這些研究都表明，較低的ANR基因表達量，致使花青素的含量上升，意味著果肉的顏色變深。3號蘋果的果肉呈紫黑色，與白色和淺紅色的1號、2號蘋果相比，相應的ANR基因表達水平應該最低，試驗已經(jīng)表明無法檢測到該基因的mRNA，確實與前述符合。目前，通過自然變異導致ANR基因沉默的研究，還沒有見到同類文獻報道。如果希望其他蘋果果肉由淺色變?yōu)樽虾谏耸褂帽驹囼灢牧想s交育種外，也可以利用基因工程手段敲除ANR基因。

4 ? ?參考文獻

[1] 宋冰雪，曲盈媛，蘇強，等.篤斯越橘花青苷合成酶基因（ANR）的克隆與序列分析[J].延邊大學農(nóng)學學報，2017，39（4）：1-6.

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[3] 王晨，房經(jīng)貴，曹雪，等.葡萄中原花青素的代謝[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（9）：169-173.

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[6] 李先良，趙志常，高愛平，等.芒果ANR基因的克隆及其表達分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（4）：22-25.

[7] 嚴娟，宋志忠，蔡志翔，等.3種果肉顏色桃原花青素積累[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2018，34（3）：651-656.