熊勤梅，肖勝艦，黃鈞，周榮清， 3，張立強(qiáng)，金垚*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065) 2(制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué))，四川 成都，610065)3(國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州，646000) 4(瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州，646000)5(瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州，646000)

青梅是藥食兩用水果，含有豐富的有機(jī)酸、多酚、多糖和萜類物質(zhì)[1]，以及多種維生素和微量元素，特別是含有17種氨基酸，其中有8種人體必需氨基酸[2]。以青梅果發(fā)酵釀造而成的青梅酒酒體呈金黃色,果香悅?cè)?可開(kāi)胃生津、改善腸胃功能[3]。然而,由于青梅酒含有蛋白質(zhì)、單寧和有機(jī)酸等成分,在貯存過(guò)程中容易產(chǎn)生沉淀,穩(wěn)定性受到破壞[4]，因而發(fā)酵結(jié)束后的澄清工藝顯得尤為重要。

近年來(lái)，微濾技術(shù)由于其過(guò)程溫和、無(wú)相變和化學(xué)添加劑的特點(diǎn)，在釀酒工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，已被證明是一種有效的澄清和除菌技術(shù)[5]。但是目前有關(guān)果酒澄清的研究絕大多數(shù)針對(duì)葡萄酒[6-8]，對(duì)于青梅酒等小眾果酒涉及甚少。對(duì)于青梅酒微濾過(guò)程的過(guò)濾行為和膜污染特征，微濾對(duì)青梅酒特性的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用2種不同孔徑的陶瓷膜對(duì)發(fā)酵型青梅酒進(jìn)行微濾澄清，分析微濾過(guò)程中膜的污染機(jī)制，并對(duì)微濾后青梅酒的基礎(chǔ)特性、有機(jī)酸含量和揮發(fā)性組分的變化進(jìn)行了分析，為發(fā)酵型青梅酒的生產(chǎn)提供理論支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅，四川省大邑縣；蔗糖，本地市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；釀酒酵母(SY)，安琪酵母股份有限公司；生香酵母(Zymaflore Alpha)，拉氟德公司；所有標(biāo)準(zhǔn)品，包括辛酸甲酯(內(nèi)標(biāo))，有機(jī)酸均由Aldrich-Sigma公司(上海)和阿拉丁試劑公司(上海)提供。

NaCl、NaOH、NaHSO3、(NH4)2HPO4、殼聚糖、硅藻土，成都科隆化學(xué)品有限公司；CuSO4、HCl、次甲基藍(lán)、葡萄糖，成都金山化學(xué)試劑有限公司；果膠酶，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CS501超級(jí)恒溫水浴鍋，上海浦東榮豐科技儀器有限公司；BS100S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CX31顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；FEB-85恒溫磁力攪拌器，上海雙捷有限公司；PHS-3C pH計(jì)，WZS-186濁度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；IR200手持式折光儀，上海儀邁儀器科技有限公司；GL-20G立式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；HPLC高效液相色譜和1260紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；Trace GC Ultra-DSQ Ⅱ氣相色譜-單沖四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Electron公司；CeraMem-0 025陶瓷膜微濾設(shè)備，廈門(mén)福美科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青梅酒的制備

選擇成熟度一致、健康無(wú)病斑的新鮮青梅，糖漬3 d。在10 L不銹鋼發(fā)酵罐中發(fā)酵，加入60 mg/kg的NaHSO3和(NH4)2HPO4抑菌及提供氮源。調(diào)整糖含量后，按一定比例加入生香酵母/釀酒酵母，并置于25 ℃靜置發(fā)酵，定期攪拌，每隔2 d檢測(cè)總糖、酒精度，并適當(dāng)補(bǔ)充糖。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%，殘余糖含量下降到5%以下時(shí)，停止發(fā)酵，倒罐去皮渣。在17 ℃后發(fā)酵10 d，粗濾后放入4 ℃冰箱備用。

1.3.2 青梅酒的澄清

本研究涉及3種澄清工藝，除了微濾澄清之外，還采用了自然澄清和澄清劑澄清作為參照對(duì)象。

1.3.2.1 自然澄清和澄清劑澄清

澄清實(shí)驗(yàn)在避光靜置1周的條件下完成。在澄清劑實(shí)驗(yàn)前期，進(jìn)行了單一澄清劑對(duì)青梅酒的澄清效果實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種復(fù)合澄清劑的最佳配方，即果膠酶(EX-V)質(zhì)量濃度1.4 g/L、殼聚糖質(zhì)量濃度1.2 g/L和硅藻土(200目)質(zhì)量濃度0.4 g/L，并在青梅酒澄清實(shí)驗(yàn)中加入了此配方的澄清劑。

1.3.2.2 陶瓷膜過(guò)濾澄清

采用孔徑0.2和0.5 μm的陶瓷膜(Al2O3、過(guò)濾面積0.032 m2)實(shí)驗(yàn)室級(jí)過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)青梅酒進(jìn)行微濾，工藝過(guò)程如圖1所示。

圖1 微濾裝置示意圖Fig.1 Scheme of microfiltration set-up

過(guò)濾系統(tǒng)由供料箱(容量2 L)通過(guò)泵供料。進(jìn)料流量為12 L/h，由流量調(diào)節(jié)閥控制。微濾溫度為20 ℃，由溫控系統(tǒng)調(diào)節(jié)控制?？缒翰?transmembrane pressure，TMP)根據(jù)膜組件進(jìn)出口壓力計(jì)算得到，本實(shí)驗(yàn)Δp=0.06 MPa。濾液槽置于電子天平(精度0.01 g)之上，每隔1 min通過(guò)實(shí)時(shí)讀取容器內(nèi)的質(zhì)量變化計(jì)算得出膜通量。

1.3.3 膜污染分析

采用2個(gè)經(jīng)典模型對(duì)青梅酒微濾進(jìn)行膜污染行為分析：Hermia膜孔堵塞模型和Resistance-in-series模型。本團(tuán)隊(duì)前期已經(jīng)對(duì)分析方法作了詳細(xì)描述[9-10]，并在本文中延用。Hermia模型基于公式(1)：

(1)

式中:t,累積時(shí)間，min;v,累積體積，L;K,常數(shù);n,阻塞指數(shù),其值隨過(guò)濾機(jī)理變化，完全堵塞為2.0，標(biāo)準(zhǔn)堵塞為1.5，中間堵塞為1.0，濾餅過(guò)濾為0[11]?？筛鶕?jù)不同過(guò)濾機(jī)制積分公式(1)并擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以擬合曲線的相關(guān)系數(shù)來(lái)判定過(guò)濾機(jī)制。

Resistance-in-series模型基于公式(2)：

Rt=Rm+Rf=Rm+Rrf+Rir

(2)

式中：Rt，過(guò)濾過(guò)程總阻力，m-1；Rm，膜阻，m-1；Rf，微濾過(guò)程中形成的膜污染阻力，m-1，為可逆阻力(Rrf)和不可逆阻力(Rir)之和[12-13]。

1.3.4 理化指標(biāo)分析

酒精度(酒精計(jì)法)、總糖(斐林試劑直接滴定法)、總酸(電位滴定法)按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 15038—2006)《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定。濁度：濁度計(jì)測(cè)定；pH：pH計(jì)測(cè)定；可溶性固形物：手持式折光儀測(cè)定；酵母菌數(shù)：顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；細(xì)菌數(shù)：平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.3.5 有機(jī)酸分析

青梅酒中有機(jī)酸的分析按照本團(tuán)隊(duì)的優(yōu)化方法進(jìn)行[14]。

1.3.6 揮發(fā)性化合物分析

揮發(fā)性化合物的檢測(cè)也是根據(jù)本團(tuán)隊(duì)的優(yōu)化方法進(jìn)行分析[10,15-17]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

以上所述所有分析均進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的形式表示。采用SPSS軟件(17.0版)中 Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，評(píng)價(jià)不同樣品成分的顯著性差異，P<0.05 (n=3)為顯著性差異。使用Origin 9.0處理所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅酒微濾過(guò)程的特性評(píng)價(jià)

青梅酒不同孔徑陶瓷膜的微濾過(guò)程中膜通量隨時(shí)間的變化如圖2-a所示，該曲線符合微濾過(guò)程的基本特征，即過(guò)濾初期快速降低，之后逐漸達(dá)到穩(wěn)態(tài)?？讖酱笮?duì)膜通量有一定的影響：膜孔越大，穩(wěn)態(tài)通量相對(duì)越高。膜通量的變化與膜污染的機(jī)制息息相關(guān)，而Hermia膜孔堵塞模型可以很好地描述微濾過(guò)程的污染行為。圖2-b展示了青梅酒的穩(wěn)態(tài)微濾實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與濾餅堵塞模型之間的擬合關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.98,可見(jiàn)在青梅酒微濾過(guò)程中，濾餅過(guò)濾是主要的膜孔堵塞機(jī)制，且與膜孔徑關(guān)系不大。

a-青梅酒微濾過(guò)程的膜通量;b-濾餅堵塞模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合曲線圖2 青梅酒微濾過(guò)程中膜通量變化以及濾餅堵塞模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合曲線Fig.2 The membrane flux of greengage wine through0.2 μm and 0.5 μm ceramic membranes and the fitting curveof experimental data by cake filtration model

另外，本研究利用Resistance-in-series模型分析了青梅酒微濾過(guò)程中的阻力分布。由表1可知，膜孔越小，微濾總阻力越大。青梅酒微濾阻力的主要來(lái)源是可逆膜污染阻力，占總阻力的90%以上，這與圖2-b揭示的濾餅堵塞模型的行為一致，因此，膜污染阻力的增加主要是由于濾餅阻力的增大，而該濾餅的阻力在孔徑較小的膜中更為顯著，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。不僅如此，孔徑更小的膜中，不可逆膜污染阻力也更大，意味著其膜通量的再生難度更大。以上結(jié)果表明，0.5 μm比0.2 μm的陶瓷膜更適合于青梅酒的微濾。

表1 不同孔徑的陶瓷膜的過(guò)濾阻力分布Table 1 Resistance distribution of ceramic membraneswith different pore sizes

2.2 微濾對(duì)青梅酒基礎(chǔ)特性的影響過(guò)程特性評(píng)價(jià)

本部分旨在分析微濾對(duì)青梅酒基礎(chǔ)理化特性的影響，采用了自然澄清和復(fù)合澄清劑澄清后的青梅酒作為對(duì)照，4個(gè)樣品的主要理化特性見(jiàn)表2。由表2可知，所有樣品的pH和酒精度幾乎無(wú)差異，而青梅酒的總糖、總酸和可溶性固形物含量在微濾處理后有不同程度的降低，其中，以0.2 μm微濾澄清后下降更為明顯，0.5 μm微濾澄清則可以較好地保留青梅酒的基礎(chǔ)特征。另外，果酒的酒體透明度和色度也是其品質(zhì)的重要指標(biāo)，這2個(gè)指標(biāo)決定于微生物、蛋白質(zhì)、礦物離子(如鐵離子)、多酚和多糖等組分的共同作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然澄清和澄清劑澄清相比，微濾處理可以更好地去除酒體中的懸浮微粒，極大降低濁度，同時(shí)，酒體色度也有所降低，產(chǎn)出的酒體晶瑩剔透、品質(zhì)典雅。微濾處理除了澄清，通常還能達(dá)到較好的除菌效果，對(duì)4個(gè)樣品的細(xì)菌/真菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，微濾處理后的青梅酒除菌效果大大優(yōu)于自然澄清和澄清劑澄清的樣品。

表2 不同青梅酒樣品的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of different greengage wine samples

2.3 微濾對(duì)青梅酒中有機(jī)酸的影響

根據(jù)5種不同濃度梯度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立了HPLC峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99，驗(yàn)證了有機(jī)酸分析的可靠性[9]。圖3展示了4種經(jīng)過(guò)不同工藝澄清的青梅酒樣品有機(jī)酸含量。

圖3 不同青梅酒樣品中的有機(jī)酸含量Fig.3 The organic acid content of different greengagewine samples

如圖3所示，青梅酒樣品中含有豐富的有機(jī)酸，其含量遠(yuǎn)超于一般的果酒，其中檸檬酸的含量最高，達(dá)到39 g/kg。無(wú)論微濾還是澄清劑澄清，與自然澄清樣品相比，有機(jī)酸含量均沒(méi)有明顯的降低，可見(jiàn)本文研究的澄清工藝均對(duì)青梅酒中的有機(jī)酸含量沒(méi)有顯著影響。

2.4 微濾對(duì)青梅酒揮發(fā)性組分的影響

本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜(headspace-solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)對(duì)青梅酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測(cè)分析，共鑒定出了57種組分。根據(jù)不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將其分為4類，包括10種醇類、9種酸類、32種酯類和6種醛酮類，見(jiàn)表3。

如圖4所示，酯類、醇類和酸類化合物是青梅酒的主要揮發(fā)性組分，經(jīng)過(guò)澄清劑和微濾澄清處理后，揮發(fā)性組分的總量均有所降低，而經(jīng)過(guò)0.2 μm微濾處理后含量降低趨勢(shì)更明顯。

表3 不同青梅酒樣品中揮發(fā)性組分的含量 單位：μg/L

續(xù)表3

圖4 不同青梅酒樣品中揮發(fā)性組分的濃度占比圖Fig.4 Concentration/proportion of volatile compounds ingreengage wine samples注：不同字母代表樣本具有顯著差異(P<0.05)

醇類物質(zhì)是果酒中主要的香氣組分，由原料中的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，香氣主要表現(xiàn)為甜香、花果香[20]。本研究檢出的醇類中，含量較高的有異戊醇、苯乙醇和萜品醇。苯乙醇是青梅酒香氣的主要貢獻(xiàn)組分之一，具有誘人的茉莉花香和玫瑰香[21]，占醇類物質(zhì)總量的80%以上。澄清處理后醇類含量的減少主要是由于苯乙醇的損失，以0.2 μm微濾處理后的損失最為嚴(yán)重。相反，0.5 μm微濾處理則展現(xiàn)出較好的苯乙醇保留率，其對(duì)醇類的總保留率也較高。

青梅酒中自然存在的酸類組分豐富，同時(shí)也可由發(fā)酵初期酵母細(xì)胞繁殖代謝以及中后期醇類物質(zhì)氧化產(chǎn)生[22]。酸類物質(zhì)可參與形成酯的過(guò)程，對(duì)果酒的香氣有調(diào)節(jié)和平衡作用[23]。其中己酸、辛酸、正癸酸為主要的揮發(fā)性酸。澄清處理后酒中酸類含量均有顯著降低，降幅達(dá)40%以上，相對(duì)而言，0.5 μm微濾處理后的酸類降幅最小，而澄清劑和0.2 μm微濾處理后的酸類降幅均已接近50%。

酯類物質(zhì)是酵母代謝產(chǎn)生的醇與積累的酸發(fā)生酯化反應(yīng)而生成[24]，是青梅酒香氣組分中最為重要的種類之一，大多數(shù)酯類具有特別的花果香氣，對(duì)成品青梅酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)大[25]。本研究檢出的酯類中，含量較高的有辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、肉桂酸乙酯等，其中丁二酸二乙酯占到酯類總含量的54%，為青梅酒中的主要酯類化合物。另外，相對(duì)于澄清劑處理，微濾澄清處理對(duì)酯類含量的影響較大，損失率達(dá)70%，可能會(huì)導(dǎo)致成品果酒花果風(fēng)味一定程度的減弱。這一現(xiàn)象我們?cè)谇捌谘芯恐幸嘤邪l(fā)現(xiàn)并報(bào)道[9-10]，包括利用不同材料不同孔徑的膜對(duì)桑葚酒和生醬油的微濾處理，都發(fā)現(xiàn)了微濾過(guò)程對(duì)揮發(fā)性組分中的酯類和醇類含量造成較顯著的降低。該現(xiàn)象可能與膜的選擇性吸附有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示其機(jī)理。

3 結(jié)論

本研究采用2種不同孔徑的陶瓷膜對(duì)青梅酒進(jìn)行微濾澄清，并評(píng)估了該工藝對(duì)青梅酒品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，青梅酒的微濾過(guò)程是濾餅過(guò)濾主導(dǎo)的，過(guò)濾阻力主要為可逆阻力，微濾處理可以除去青梅酒中的殘余微生物，并使成品酒獲得較高的透明度，同時(shí)不會(huì)顯著影響青梅酒中的有機(jī)酸含量。然而，由微濾處理導(dǎo)致青梅酒中揮發(fā)性組分的損失不可忽略，尤其是酯類組分的損失，可能會(huì)減弱成品酒的花果香風(fēng)味。最后，0.5 μm陶瓷膜可以較大程度地保留青梅酒的特性，比0.2 μm陶瓷膜更適合于青梅酒的澄清。