高夢(mèng)迪,盛茂銀,3*

(1.貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院,貴州 貴陽 550001;2.國(guó)家喀斯特石漠化治理工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550001;3.貴州省喀斯特石漠化防治與衍生產(chǎn)業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550001)

0 引言

納米材料是指由極細(xì)晶粒組成、特征維度尺寸在納米量級(jí)(0.1～100 nm)的固體材料。由于納米材料具有小尺寸效應(yīng)、表面界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)等特殊的物理化學(xué)特性，故在諸多領(lǐng)域都被關(guān)注[1]。鈦(Ti)是一種對(duì)植物有顯著影響的有益元素，與許多其他重金屬一樣，在低濃度處理下，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用，而在高劑量下處理，對(duì)植物具有毒性作用[2]。納米TiO2作為一種常見的金屬氧化物納米材料，具有無毒、催化活性高、穩(wěn)定性好以及抗氧化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在化妝品制造、生物制藥、空氣凈化和廢水處理等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3-5]，但在植物領(lǐng)域卻存有巨大差異的研究結(jié)論，如對(duì)植物產(chǎn)生毒性效應(yīng)：造成DNA損傷[6]、抑制種子萌發(fā)與根系生長(zhǎng)[7]、降低植物生物量[8]、干擾植物細(xì)胞分裂[9]、干擾植物蛋白合成[10]等；也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著納米TiO2濃度的增加，植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽率指數(shù)、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)、鮮重、活力指數(shù)、葉綠素含量顯著增加[11-12]；納米TiO2能有效提高藏紅花的抗氧化活性，能提高藏紅花的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]；在多數(shù)情況下，納米TiO2對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響多表現(xiàn)出高濃度抑制低濃度促進(jìn)的現(xiàn)象[14-15]。由于目前納米TiO2對(duì)植物的影響機(jī)制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)：納米TiO2誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過量活性氧，導(dǎo)致植物中的氧化脅迫，誘導(dǎo)其產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和 DNA 損傷[16-17]；納米TiO2通過根到葉，或果實(shí)、葉子到根的途徑在植物系統(tǒng)中完成吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，在這一過程中納米TiO2能夠促進(jìn)植物對(duì)一些營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[18]，但是如果納米TiO2在植物組織內(nèi)不斷富集，超過植物本身的代謝能力，就會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[19]。因此，在不同的條件下考察納米TiO2的不同處理方法對(duì)植物的生物學(xué)效應(yīng)十分必要。

草地是生態(tài)修復(fù)、石漠化治理模式中不可或缺的組分[20]。黑麥草和高羊茅因適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，為喀斯特石漠化恢復(fù)地區(qū)優(yōu)先選取草本植物[21]。本研究以黑麥草和高羊茅作為受試物種，研究不同濃度納米TiO2對(duì)其種子萌發(fā)、根伸長(zhǎng)、抗氧化酶活性、葉綠素含量等指標(biāo)的影響，以期為納米材料在草本植物的遺傳育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

納米TiO2粉末由贏創(chuàng)特種化學(xué)(上海)有限公司提供，其型號(hào)為AEROXIDE P25，銳鈦礦80%，金紅石20%，平均粒徑21 nm，SPE的表面面積50 m2·g-1，純度大于99.5%。黑麥草與高羊茅種子購于江蘇三春暉種業(yè)。

主要儀器：恒溫水浴鍋；數(shù)控超聲波清洗器；光照培養(yǎng)箱(MGC-300B) ；恒溫振蕩器；紫外可見分光光度計(jì)；高速冷凍離心機(jī)；根系掃描儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米懸浮液的制備與種子預(yù)處理

分別稱量納米TiO2干粉0.01 g、0.02 g、0.04 g和0.08 g，懸浮于100 mL超純水中。將懸浮液在超聲波清洗儀中以320 W的強(qiáng)度超聲處理30 min后，即得到濃度分別為100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1和800 mg·L-1的納米TiO2懸浮液，以超純水作空白對(duì)照試驗(yàn)。收集顆粒飽滿，品質(zhì)良好的種子，用10%次氯酸鈉溶液消毒20 min，再用純水沖洗5次，將漂浮的劣質(zhì)種子去除，保存于無菌密封袋中，貼上標(biāo)簽備用。

1.2.2 種子的萌發(fā)與培養(yǎng)

將處理好的黑麥草種子和高羊茅種子分別浸泡于100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1和800 mg·L-1濃度的納米TiO2懸浮液中，以超純水(0 mg·L-1TiO2)處理為對(duì)照，放入恒溫振蕩器中以170 r·min-1轉(zhuǎn)速震蕩混合，24 h后取出用超純水清洗4次。用5 mL超純水將濾紙浸濕，每?jī)善瑸V紙放在1個(gè)直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放10粒種子。將培養(yǎng)皿用透氣不透水的薄膜(PM-996 Parafilm M)包裹密封，并置于光照培養(yǎng)箱中催芽，溫度設(shè)為20 ℃，無光照，每個(gè)處理3次重復(fù)，連續(xù)2 d沒有新的種子發(fā)芽為實(shí)驗(yàn)結(jié)束。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將幼苗移至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)環(huán)境設(shè)置為：白天溫度25 ℃，光照6 000 lx，時(shí)間14 h；夜晚溫度20 ℃，無光照，時(shí)間10 h。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算方法

1.2.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)與根系形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開始后每24 h觀察1次并記錄種子萌發(fā)數(shù)，以胚根突破種皮2 mm作為種子發(fā)芽的標(biāo)志，連續(xù)2 d沒有新的種子發(fā)芽為實(shí)驗(yàn)結(jié)束，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。將幼苗轉(zhuǎn)移至霍格蘭培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)15 d后，測(cè)定各濃度納米TiO2溶液處理的所有黑麥草和高羊茅幼苗的根系形態(tài)以及地上、地下部鮮重。

計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中，M為供試種子粒數(shù)；M1為全部正常發(fā)芽粒數(shù)；M2為達(dá)到發(fā)芽高峰期的種子數(shù)；Gt為時(shí)間t內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

幼苗生長(zhǎng)15 d后，將植株幼苗取出，用超純水小心沖洗3次后用濾紙吸干其表面水分，稱其鮮重，保留小數(shù)點(diǎn)后2位。由于單株植物幼苗鮮重過小，為直觀展現(xiàn)鮮重的變化趨勢(shì)，黑麥草在各個(gè)處理濃度下取30株進(jìn)行稱量，高羊茅取20株，每種濃度重復(fù)取樣3次。

根長(zhǎng)，根表面積，總投影面積，根體積和根尖數(shù)等指標(biāo)采用STD 4800 SCANNER根系掃描儀對(duì)不同濃度納米TiO2溶液處理下植物幼苗的根系進(jìn)行掃描，采用WinRHIZO TRON MF圖像分析軟件對(duì)根系指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3.2 幼苗生理指標(biāo)測(cè)定

酶液的制備：取0.1 g幼苗葉片擦洗干凈，加入1 mL的磷酸緩沖液(0.05 moL·L-1，pH 7.0)研磨為勻漿，將勻漿倒入離心管，用PBS沖洗，定容至5 mL，在4 ℃，12 000 r·min-1條件下冷凍離心10 min，上清液即為待測(cè)酶液，置于4 ℃冰箱待用。過氧化物酶(POD) 的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[22]。丙二醛(MDA)的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[22]。葉綠素的測(cè)定采用丙酮乙醇混合液法[23]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅種子萌發(fā)的影響

由表1可知：不同濃度的納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)都有不同程度的促進(jìn)作用；黑麥草和高羊茅的發(fā)芽率雖然都高于對(duì)照組，但均沒有顯著性差異；在納米TiO2濃度為200 mg·L-1時(shí)黑麥草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，分別提高了27.2%和44.3%，存在顯著性差異；在納米TiO2濃度為100 mg·L-1時(shí)高羊茅種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，分別提高了63.6%和42.9%，存在顯著性差異。

表1 納米TiO2處理下黑麥草和高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)Tab.1 The germination rate, germination index and germination energy of L. perenne and F. arundinacea seeds treated by Nano-TiO2

2.2 納米TiO2對(duì)種子根系形態(tài)與幼苗生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)于霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液15 d的黑麥草和高羊茅幼苗取出，測(cè)定其根系形態(tài)，結(jié)果見表2。由表2可知：當(dāng)納米TiO2濃度為100 mg·L-1時(shí)對(duì)黑麥草和高羊茅幼苗的根系生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用；在100 mg·L-1濃度下黑麥草的根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)分別高于對(duì)照組33.8%、47.8%、33.12%和23.8%，存在顯著性差異，其余濃度處理組均不同程度的抑制了黑麥草根系的生長(zhǎng)；在100 mg·L-1濃度下對(duì)高羊茅的根尖數(shù)具有顯著促進(jìn)作用，高于對(duì)照組36.9%，對(duì)根長(zhǎng)、根表面積、根體積的促進(jìn)作用明顯，但不存在顯著性差異；隨著納米TiO2濃度的增加，高羊茅幼苗的根系生長(zhǎng)受到了明顯的抑制作用。

表2 不同濃度的納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅種子根系形態(tài)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Nano-TiO2 on root morphology of L. perenne and F. arundinacea

2.3 納米TiO2對(duì)種子幼苗生理生化特征的影響

由表3可知：在各濃度納米TiO2溶液處理下均不同程度的降低了黑麥草幼苗的葉綠素含量和鮮重，在濃度為800 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值，分別低于對(duì)照組23.0%和45.6%，具有顯著性差異；在各濃度納米TiO2溶液處理下，黑麥草POD 活性均高于對(duì)照組，且在濃度為800 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，比對(duì)照極顯著增加217.95%，而MDA含量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，具有顯著的濃度效應(yīng)，分別在濃度為100 mg·L-1和800 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值和最高值；各濃度納米TiO2溶液處理的高羊茅幼苗的葉綠素含量都顯著低于對(duì)照組，其含量在濃度為400 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值，低于對(duì)照組31.3%，具有顯著性差異；各濃度納米TiO2處理下高羊茅葉片的POD活性和MDA含量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，其中在處理濃度為100 mg·L-1時(shí)同時(shí)達(dá)到最低值，分別比對(duì)照降低了76.9%和74.6%；在處理濃度為400 mg·L-1時(shí)POD活性達(dá)到最高值，比對(duì)照極顯著增加了124.19%，在處理濃度為800 mg·L-1時(shí)MDA含量達(dá)到最高值，比對(duì)照極顯著增加了1 476.87%。

表3 納米TiO2處理下黑麥草葉片的POD、MDA、葉綠素含量和鮮重Tab.3 POD, MDA, chlorophyll content and fresh weight of L. perenne and F. arundinace a leaves treated with Nano-TiO2

3 討論

本試驗(yàn)選取了黑麥草和高羊茅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅種子的萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用，但是最適濃度有所不同。黑麥草在納米TiO2濃度為200 mg·L-1時(shí)對(duì)其種子萌發(fā)的促進(jìn)效果最佳，高羊茅則在納米TiO2濃度為100 mg·L-1時(shí)其種子萌發(fā)效果最好。這種促進(jìn)作用可能是由于納米TiO2生物親和性較高，在低濃度處理下納米TiO2可以穿透植物種皮，對(duì)種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)有顯著影響[24]。由于成熟種子相對(duì)干燥，需要吸收大量的水分才能恢復(fù)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，有研究證明納米材料由于小尺寸效應(yīng)而影響了植物內(nèi)部滲透水的能力，創(chuàng)造了通道，從而提高了植物的吸水能力[25]，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2對(duì)黑麥草和高羊茅的根系生長(zhǎng)以及鮮重均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的現(xiàn)象。這可能是納米TiO2的高催化性和表面界面效應(yīng)，使其在低濃度下能夠催化植物根系中的酶活性，有效促進(jìn)其水分和養(yǎng)分的吸收，使得植物根長(zhǎng)、根表面積、總投影面積、根體積和根尖數(shù)有所增加，進(jìn)而增加了植物的幼苗鮮重。但當(dāng)納米TiO2濃度過高時(shí)則會(huì)產(chǎn)生相反的效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，過高濃度的納米材料會(huì)干擾植物根冠生長(zhǎng)激素分布，破壞根伸長(zhǎng)區(qū)微管正常排列，并擾亂根分生區(qū)細(xì)胞分裂[26]，從而顯著抑制植物根系的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各濃度納米TiO2處理都能夠顯著提高黑麥草幼苗葉片的POD活性。其原因可能是在納米TiO2脅迫下會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，隨著處理濃度的增加ROS產(chǎn)生量越大，為清除過量ROS，POD活性也隨著增加，從而提高黑麥草幼苗的抗氧化能力。各濃度納米TiO2處理下高羊茅葉片的POD活性呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，這表明低濃度的納米TiO2對(duì)高羊茅抗氧化酶活性具有刺激作用，這與Rico等[27]的研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)中黑麥草和高羊茅葉片MDA含量均呈現(xiàn)出先降低后升高的現(xiàn)象，說明在低濃度納米TiO2處理下抗氧化酶活性確實(shí)降低了植物葉片細(xì)胞膜的損傷。各濃度納米TiO2處理下黑麥草葉綠素含量均顯著低于對(duì)照組，高羊茅僅在處理濃度為100 mg·L-1時(shí)葉綠素含量與對(duì)照組無顯著性差異，該結(jié)果與施夏明等[28]研究結(jié)果一致，其原因可能是高濃度納米TiO2可能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生過量ROS，進(jìn)而氧化葉綠素，降低植物光合作用。也有研究證明金屬氧化物納米顆粒會(huì)被植物吸收并吸附并聚集在葉綠體表面[29]，葉細(xì)胞中有大量的納米TiO2團(tuán)聚體使細(xì)胞壁折疊、內(nèi)陷，橢圓葉綠體變圓，類囊體膨脹解體，殘存的基粒和基質(zhì)類囊體更加腫脹、疏松，導(dǎo)致葉綠素含量降低[30]，影響植物的光合作用，從而抑制植物幼苗生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)在納米TiO2處理濃度為100 mg·L-1時(shí)黑麥草和高羊茅的葉綠素含量均在一定程度上低于對(duì)照，但二者的鮮重并未與對(duì)照產(chǎn)生顯著性差異，甚至高羊茅的鮮重高于對(duì)照14.67%。這可能是該處理濃度下幼苗的根系生長(zhǎng)顯著優(yōu)于對(duì)照，有助于吸收營(yíng)養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和無機(jī)鹽，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。Alimohammadi等[31]在番茄對(duì)碳納米管的混合反應(yīng)中顯示，當(dāng)生物量增加時(shí)，葉綠素含量下降。

研究初步表明，低濃度的納米TiO2(100 mg·L-1)對(duì)黑麥草和高羊茅種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用，這可能是低濃度的納米TiO2對(duì)草本植物具有較強(qiáng)的親和性，能夠催化植物根系的酶活性。但隨著處理濃度的增加，納米TiO2在植物組織內(nèi)富集，葉綠素含量降低，細(xì)胞膜嚴(yán)重?fù)p傷，黑麥草和高羊茅幼苗的生長(zhǎng)及發(fā)育受到顯著抑制作用。