張浩　馬犇　程楊

摘要 目的：研究雷公藤內(nèi)酯醇（TP）用于荷卵巢癌大鼠的抑瘤效應(yīng)及其對免疫系統(tǒng)的影響。方法：選取性SD大鼠作為實驗動物，皮下注射卵巢癌細(xì)胞后得到荷卵巢癌大鼠，分為腹腔注射生理鹽水的對照組、低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組。藥物干預(yù)后測定腫瘤的質(zhì)量和體積、腫瘤組織中抑癌基因的表達(dá)量、外周血中免疫細(xì)胞因子的水平。結(jié)果：低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠的腫瘤質(zhì)量與體積、外周血中白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的水平均明顯低于對照組，腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量以及外周血中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平均明顯高于對照組且TP劑量越大，腫瘤質(zhì)量與體積、外周血中IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量以及外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高。結(jié)論：TP用于荷卵巢癌大鼠具有顯著的抑瘤效應(yīng)，能夠抑制腫瘤生長、增加抑癌基因表達(dá)并調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞 卵巢癌;雷公藤內(nèi)酯醇;荷瘤鼠;抑癌基因;免疫應(yīng)答

Antitumor Effects of Triptolide on Tumor Ovarian Cancer Bearing Rats and Effects of Triptolide on Immune System

ZHANG Hao，MA Bei，CHENG Yang

（ Department of Gynaecology，the First People′s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510180，China）

Abstract Objective：To study the antitumor effects of Triptolide （TP） used in rats with ovarian cancer and its influence on the immune system.Methods：Female SD rats were selected as experimental animals，and ovarian cancer-bearing rats were obtained after subcutaneous injection of ovarian cancer cells.They were divided into a model group，a low-dose TP group，a middle-dose TP group，and a high-dose TP group injected with physiological saline.After drug intervention，the weight and volume of the tumor，the expression of tumor suppressor genes in the tumor tissue，and the content of immune cytokines in the peripheral blood were measured.Results：Tumor weight and volume，interleukin-4 （IL-4） in peripheral blood，interleukin-17 （IL-17），and transforming growth factor β1 （TGF-β1） in rats in the low-dose，middle-dose，and high-dose TP groups were significantly lower than the model group，and the expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin mRNA in tumor tissues and interferon-γ （IFN-γ） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in peripheral blood were significantly higher than the model group.The greater the TP dose，the lower the tumor weight and volume，and the content of IL-4，IL-17，and TGF-β1 in the peripheral blood，the higher the mRNA expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin in the tumor tissue，and the higher the content of IFN-γ and TNF-α in peripheral blood.Conclusion：TP has a significant tumor suppressing effects on ovarian cancer-bearing rats，which can inhibit tumor growth，increase tumor suppressor gene expression and regulate anti-tumor immune response.

Keywords Ovarian cancer; Triptolide; Tumor bearing mice; Tumor suppressor gene; Immune response

中圖分類號：R284;R711文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.011

卵巢癌是臨床上常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期診斷難度大，確診時多已發(fā)展至中晚期，通過細(xì)胞減滅術(shù)、放化療雖然能夠在一定程度上殺傷癌細(xì)胞、控制腫瘤病情發(fā)展，但整體預(yù)后并不理想、5年生存率不足30%[1-2]。近年來，越來越多的學(xué)者致力于探尋卵巢癌質(zhì)量的新藥物。雷公藤內(nèi)酯醇（TP）是從中藥材雷公藤中分離得到的活性成分，屬于二萜內(nèi)酯類化合物，具有廣泛的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性[3]。已有細(xì)胞實驗研究證實，雷公藤內(nèi)酯醇對離體培養(yǎng)卵巢癌的增殖具有顯著抑制作用[4]，但雷公藤內(nèi)酯醇是否能夠在活體卵巢癌病灶中發(fā)揮抗腫瘤作用仍不明確。我們以荷卵巢癌大鼠為研究模型，具體分析了雷公藤內(nèi)酯醇的抑瘤效應(yīng)及其對免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取由大學(xué)實驗動物中心提供雌性SD大鼠，2月齡、體質(zhì)量220～300 g，動物許可證號：SYXK（粵）2015-0104。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±1.3）℃，濕度（50±2）%，12 h/12 h晝夜交替。

1.1.2 藥物

雷公藤內(nèi)酯醇購買于美國Sigma公司，批號：283922。

1.1.3 試劑與儀器

卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株（ATCC公司，美國，貨號：5346-2），細(xì)胞培養(yǎng)所用RPMI1640培養(yǎng)基（批號：46522）、胎牛血清（貨號：Ta3695）、胰蛋白酶（貨號：694358）均購于美國Hyclone公司，基因mRNA表達(dá)量檢測所用試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，批號：1675-11），酶聯(lián)免疫吸附試驗（Elisa）試劑盒（上海西唐生物公司，批號：436-3）。

1.2 方法

1.2.1 分組及荷卵巢癌大鼠制作

荷卵巢癌大鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組，復(fù)蘇卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株后用含有10%胎牛血清的RMPI1640進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)增后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，重懸細(xì)胞后加入適量RMPI1640、將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2×107/mL;取0.2 mL細(xì)胞懸液、接種在大鼠右側(cè)腋窩的皮下，繼續(xù)喂養(yǎng)5～7 d后形成0.4 cm×0.4 cm的腫瘤病灶，用于后續(xù)分組及藥物干預(yù)。

1.2.2 干預(yù)方法

對照組每天給予生理鹽水2 mL腹腔注射，低劑量TP組、中劑量TP組、高劑量TP組分別按照0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg的劑量將雷公藤內(nèi)酯醇溶于2 mL生理鹽水并進(jìn)行腹腔注射。4組大鼠均連續(xù)給藥5 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

腫瘤質(zhì)量與體積的測定：給藥5次后，第2天采用頸椎脫臼法處死大鼠，分離腫瘤組織并在電子天平上稱重，而后測量腫瘤組織的長徑a和短徑b、按照公式ab2/2計算腫瘤體積。

腫瘤組織中基因 mRNA表達(dá)量的測定：完成腫瘤質(zhì)量與體積的測定后，按照試劑盒Ultrapure RNA Kit進(jìn)行操作并提取腫瘤組織中的RNA，而后按照試劑盒SuperRT One Step RT-PCR Kit配置反轉(zhuǎn)錄體積、合成cDNA;取cDNA與2×Taq Plus MasterMix反應(yīng)液及引物混合為PCR反應(yīng)體系，按照95 ℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72 ℃ 25 s的程序重復(fù)40次，得到反應(yīng)曲線及循環(huán)閾值（Ct）后按照公式2-△△Ct計算基因的mRNA表達(dá)量。PCR引物序列及退火溫度見表1。

外周血中細(xì)胞因子的測定：處死大鼠后，收集外周血標(biāo)本，采用Elisa試劑盒測定干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠的腫瘤質(zhì)量與體積 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠的腫瘤質(zhì)量與體積均明顯降低且TP劑量越大，腫瘤質(zhì)量與體積越低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 4組大鼠腫瘤組織內(nèi)抑癌基因的表達(dá)量 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量均明顯升高且TP劑量越大，腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 4組大鼠外周血中免疫細(xì)胞因子的水平 與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量TP組大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明顯升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明顯降低且TP劑量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

卵巢癌的早期癥狀不典型、診斷率較低，多數(shù)患者確診時已經(jīng)發(fā)展至中晚期并錯過了根治性切除的時機(jī)，此時只能選擇細(xì)胞減滅術(shù)、放化療等治療手段來殺傷癌細(xì)胞、延緩腫瘤的病程，但整體預(yù)后不理想且5年生存率較低。近年來，中藥材的抗腫瘤作用受到了越來越多的關(guān)注，多種中藥材被證實具有抗腫瘤活性，其中TP是中藥材雷公藤中的活性提取物，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中被證實具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性[5-6]。細(xì)胞實驗研究結(jié)果表明，TP能夠明顯降低離體培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞的增殖活力，能夠在離體水平發(fā)水抗腫瘤效應(yīng)[7]，但TP在卵巢癌活體病灶內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)尚未見明確報道。在本研究中，為了明確TP在卵巢癌活體病灶內(nèi)的抑瘤效應(yīng)，我們采用皮下注射卵巢癌細(xì)胞的方式建立了荷卵巢癌大鼠模型并以該模型為研究對象，通過腹腔注射TP的方式進(jìn)行干預(yù)，由藥物干預(yù)后腫瘤質(zhì)量和體積的分析可知：TP組大鼠的腫瘤質(zhì)量與體積均明顯降低且TP劑量越大，腫瘤質(zhì)量與體積越低。這一結(jié)果說明TP在荷卵巢癌大鼠體內(nèi)具有抑瘤效應(yīng)，能夠以劑量依賴性的方式降低腫瘤的質(zhì)量和體積。

在卵巢癌的病理進(jìn)程中，局部病灶內(nèi)抑癌基因表達(dá)缺失與癌細(xì)胞增殖、侵襲活力的增強(qiáng)有關(guān)，多種抗腫瘤藥物能夠以抑癌基因為作用表達(dá)、通過激活抑癌基因來抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲。PTEN、ST7L、Bax是與卵巢癌細(xì)胞凋亡直接相關(guān)的抑癌基因，PTEN的編碼產(chǎn)物具有磷酸酶活性，在催化MAPK、PI3K、AKT等信號分子發(fā)生去磷酸化的基礎(chǔ)上抑制信號通路活化、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8];ST7L基因與Wnt2成簇表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能夠使細(xì)胞周期發(fā)生停滯并迅速進(jìn)入凋亡程序[9-10];Bax基因的編碼產(chǎn)物屬于Bcl-2家族，能夠在線粒體膜上拮抗Bcl-2的活性并增加線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而通過細(xì)胞色素C的活性來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)放大[11]。TIMP1、E-cadherin是與卵巢癌細(xì)胞侵襲密切相關(guān)的抑癌基因，前者通過拮抗多種蛋白酶水解細(xì)胞外基質(zhì)的活性來抑制癌細(xì)胞侵襲，后者通過增強(qiáng)細(xì)胞間極性及黏附性來抑制癌細(xì)胞侵襲[12-13]。本研究對荷卵巢癌大鼠腫瘤組織中上述抑癌基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)：TP組大鼠腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量均明顯升高且TP劑量越大，腫瘤組織內(nèi)PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量越高。說明TP在荷卵巢癌大鼠體內(nèi)具有增加抑癌基因表達(dá)的效應(yīng)，通過改變抑癌基因的表達(dá)能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞侵襲，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長的抑瘤效應(yīng)。

當(dāng)卵巢癌進(jìn)展至中晚期后，患者體內(nèi)存在顯著的抗腫瘤免疫應(yīng)答紊亂，癌細(xì)胞容易發(fā)生免疫逃逸并不斷生長。CD4+T細(xì)胞是在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)的重要細(xì)胞，能夠分泌不同的免疫細(xì)胞因子并在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮不同作用[14]。Th1是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的CD4+T細(xì)胞亞群，通過分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子來殺傷癌細(xì)胞[15];Th2是介導(dǎo)體液免疫的CD4+T細(xì)胞亞群，通過分泌IL-4等細(xì)胞因子一方面能夠使B細(xì)胞發(fā)生活化并參與體液免疫，另一方面也能使Th1的分化受到抑制并削弱Th1所介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)[16];Th17是特異性分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞亞群，該細(xì)胞亞群所分泌的IL-17具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的效應(yīng)[17];Treg是具有免疫抑制活性的CD4+T細(xì)胞亞群，通過分泌TGF-β1等抑制性細(xì)胞因子來使機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答活性減弱[18]。本研究對荷卵巢癌大鼠外周血中上述免疫細(xì)胞因子水平的分析發(fā)現(xiàn)：TP組大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明顯升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明顯降低且TP劑量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低。這一結(jié)果說明TP在荷卵巢癌大鼠體內(nèi)具有調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用，通過增加Th1細(xì)胞因子的分泌并減少Th2、Th17、Treg細(xì)胞因子的分泌來增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

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（2018-08-22收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）

基金項目：廣東省醫(yī)學(xué)科研課題（A2013588）作者簡介：張浩（1978.01—），男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)婦科腫瘤臨床工作，E-mail：zhalidortor@163.com