李翠，陳東亮，陳曉英，雷明，郭曉云，繆劍華

廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023

長久以來中藥用傳統(tǒng)方式為世人健康服務(wù)，其需求量正隨著人們對健康生活需求的提升而不斷增長。全世界75%以上的人口以植物作為治療、預(yù)防疾病的藥物來源。全國中藥資源普查資料顯示，我國目前處于瀕危狀態(tài)的植物有近3000種，其中藥用植物占60%～70%，特別是珍稀瀕危野生藥用植物資源量急劇下降，如紅景天、金線蓮和冬蟲夏草等，更是面臨著滅絕的危險(xiǎn)。因此，藥用植物資源的保護(hù)同其他重要資源的保護(hù)一樣，具有非常重要的戰(zhàn)略意義。

藥用植物保存方式主要有原位保存和離位保存。離位保存主要為種子保存和離體保存。超低溫保存是20世紀(jì)60年代新興的一門技術(shù)，其為種質(zhì)資源離體保存開辟了一條新路徑。藥用植物超低溫保存是指將藥用植物的莖尖、種子或花粉等組織或器官在超低溫冰箱(-80 ℃)、液氮蒸汽相(-150～-180 ℃)或液氮(-196 ℃)中冷凍保存并成功復(fù)蘇的方式[1]，目前最主要的冷源為液氮。

1 藥用植物超低溫保存原理及優(yōu)勢

超低溫保存原理主要有細(xì)胞凍害理論和溶液玻璃化理論2種。從本質(zhì)上講，藥用植物超低溫保存主要是藥用植物細(xì)胞、組織、器官等在超低溫冷凍過程中，細(xì)胞的生長和酶的代謝活動(dòng)接近停止，處于 “假死 ” 狀態(tài)，當(dāng)其恢復(fù)到合適條件時(shí)又能進(jìn)行正常的生長發(fā)育。在這一系列過程中，藥用植物細(xì)胞僅發(fā)生了可逆的物理結(jié)構(gòu)變化，化學(xué)組成并沒有發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，避免了材料在保存過程中可能造成的細(xì)胞活性損傷及遺傳性狀的退化和變異，因此其在解凍后仍然能保持正常細(xì)胞的生長、代謝活性、形態(tài)發(fā)生潛能及遺傳穩(wěn)定性[2]。

相對活體保存、種子保存等其他種質(zhì)資源保存方法，藥用植物超低溫保存不受季節(jié)、土壤、氣候等自然環(huán)境條件影響，能使保存的材料免受病、蟲、毒的侵害，便于國際和地區(qū)間的種質(zhì)交換，隨時(shí)快速繁殖大量健康植株，保存過程可以減少大量人力、物力和財(cái)力，更重要的是使種質(zhì)資源得以長期保存且不需考慮基因丟失、遺傳變異等問題。超低溫保存已成為目前公認(rèn)的最為安全、經(jīng)濟(jì)、有效的藥用植物種質(zhì)資源保存方法，尤其是針對中間性種子藥用植物、頑拗性種子藥用植物及無性繁殖藥用植物材料。

2 藥用植物超低溫保存技術(shù)

2.1 材料的選擇

材料大小、抗凍性及細(xì)胞的生理狀態(tài)和年齡等因素對超低溫保存效果有較大的影響，其中植物細(xì)胞的生長年齡是決定復(fù)蘇率的最重要因素[3]，因此，應(yīng)根據(jù)植物種類，選擇適宜進(jìn)行超低溫保存的材料類型并適時(shí)取材。藥用植物超低溫保存材料主要有幼嫩組織、組織培養(yǎng)物和植物器官三大類。從目前的研究來看，大多數(shù)植物材料在成熟期的冷凍保存效果較好。種子在形態(tài)后熟和生理后熟過程中自由水含量大大降低，是目前超低溫保存應(yīng)用最多的藥用植物材料，而體積小、細(xì)胞質(zhì)稠密、無液泡、薄壁的小分生細(xì)胞的存活率高于含大量液泡的大細(xì)胞。

藥用植物的一些幼嫩組織(如莖尖分生組織和芽)因細(xì)胞分化程度低、在保存后的再生過程中遺傳穩(wěn)定性好，是超低溫保存的理想材料[2]。目前，已成功實(shí)現(xiàn)高山紅景天、百合等藥用植物莖尖的超低溫保存，液氮冷凍保存后莪術(shù)莖尖的成活率達(dá)到90%以上[4]。愈傷組織本身極易發(fā)生染色體的自發(fā)畸變而變異且胚狀體一般是由愈傷組織分化而來，因此，藥用植物愈傷組織和胚狀體是最常見的超低溫保存組織培養(yǎng)物。目前，已成功實(shí)現(xiàn)人參等植物的愈傷組織和浙貝母等植物的胚狀體的超低溫保存，且保存后成活率均在60%以上[25]。花粉和種子是藥用植物超低溫保存的2類器官材料。由于花粉和一些種子的生長壽命時(shí)間較短而遺傳多樣性又極其豐富，所以花粉和種子的保存對完善藥用植物種質(zhì)資源具有重要的意義。

2.2 材料的預(yù)處理

超低溫保存成功的關(guān)鍵在于藥用植物組織含水量的多少。低溫冰凍及化凍過程會(huì)使保存材料細(xì)胞內(nèi)水結(jié)冰、降低細(xì)胞的含水量，對材料進(jìn)行適當(dāng)脫水是植物組織保存的關(guān)鍵[3]。低溫馴化、黑暗培養(yǎng)等也是超低溫保存常用的預(yù)處理方法。

2.2.1干燥 材料含水量是決定超低溫保存能否成功的關(guān)鍵。含水量過高植物內(nèi)易形成冰晶造成機(jī)械性損傷；含水量過低會(huì)對植物組織細(xì)胞內(nèi)的束縛水進(jìn)行破壞，造成組織死亡。適當(dāng)?shù)拿撍軠p少細(xì)胞的損害，提高材料成活率[5]。常維霞等[6]對油茶花粉含水量的超低溫保存效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明經(jīng)脫水處理后，花粉活性隨含水量降低而降低，液氮保存后的花粉萌發(fā)率均先升高后下降，油茶花粉經(jīng)過3～5 h脫水，含水量為14.46%～15.70%時(shí)保存效果最好。曾琳等[7]研究表明，降香黃檀種子超低溫保存后發(fā)芽率和生活力隨著含水量的變化而變化，當(dāng)降香黃檀種子含水量由 15.04%降至 8.14%時(shí)，其發(fā)芽率由82.67%下降至18.35%，生活力由 85.0%降至25.0%，超低溫保存效果最好的條件是種子含水量為 15.04%。在花粉的保存中也有類似研究，當(dāng)桃葉衛(wèi)矛花粉在含水量為14.56%的初始狀態(tài)時(shí)，液氮保存后的花粉全部死亡，當(dāng)含水量降低到4.14%～12.32%時(shí)，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，而當(dāng)花粉含水量降至1.67%時(shí)，花粉萌發(fā)率又開始下降，最終全部死亡[8]。因此，含水量與超低溫保存材料的萌發(fā)率關(guān)系緊密，是超低溫保存能否成功的關(guān)鍵因素。

2.2.2低溫馴化及暗培養(yǎng) 低溫鍛煉又稱冷馴化，通常是指將生物材料置于4～10 ℃低溫處理，可以提高藥用植物的抗凍能力。低溫可以激活藥用植物體內(nèi)的抗寒機(jī)制，通過一定時(shí)間的低溫暗培養(yǎng)馴化，可以有效提高細(xì)胞膜磷脂的不飽和程度和藥用植物體內(nèi)多胺和脯氨酸的含量，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗凍蛋白[9]，發(fā)生保護(hù)性脫水，提高植物的成活率。但是低溫馴化時(shí)間過長會(huì)造成的試管苗成活率下降、葉片枯黃脫落等現(xiàn)象，可能是由于在冰箱的低溫暗培養(yǎng)中，植物缺少光照、生活力減弱，導(dǎo)致植物超低溫保存后成活率下降。研究表明香石竹植株在4～8 ℃馴化后凍存，成活率達(dá)70%～80%[10]；懷山藥在低溫鍛煉7 d時(shí)成活率達(dá)最大值[11]；薄濤等[12]將繼代生長30 d的蛇莓試管苗于4 ℃冰箱中低溫鍛煉0、1、2、3、4、5、6周，經(jīng)超低溫保存后發(fā)現(xiàn)，鍛煉4周時(shí)蛇莓莖尖保存后成活率達(dá)到(28.00±5.70)%，未經(jīng)鍛煉的莖尖存活率僅為(7.00±2.74)%，但隨鍛煉時(shí)間延長，保存后莖尖存活率呈下降趨勢，鍛煉5～6周時(shí)，試管苗逐漸變黃脫葉，成活率顯著下降。因此，要合理控制低溫馴化時(shí)間。

2.3 保護(hù)劑的使用

藥用植物材料的脫水時(shí)間具有種間特異性，根據(jù)不同藥用植物的保存部位，通過改變裝載時(shí)間、冰凍保護(hù)劑、脫水時(shí)間、化凍方法等可得到適宜的冷凍保存方法。冷凍保護(hù)劑的使用是為了避免在冷凍過程中形成細(xì)胞內(nèi)冰晶，同時(shí)可以弱化水結(jié)晶,確保溶液呈高冷狀態(tài)，但其對植物均有一定的毒害作用，作用時(shí)間過長會(huì)造成細(xì)胞過度脫水，成活率下降[13]。目前應(yīng)用最廣泛的冷凍保護(hù)劑是PVS2。

李俊慧等[14]將不同玻璃化液處理的香蕉莖尖超低溫保存后的再生率進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)PVS2效果最好，其次是PVS4，但PVS4處理的結(jié)果穩(wěn)定性不好。枇杷莖尖的超低溫保存結(jié)果表明，莖尖在PVS2處理50 min時(shí)成活率最高，可達(dá)50.3%，少于50 min時(shí)由于莖尖脫水不完全而成活率不高，超過50 min則受到PVS2毒害也不易成活[15]。在馬鈴薯莖尖的研究結(jié)果類似，王家福等[16]發(fā)現(xiàn)在60%PVS2處理30 min后的莖尖成活率最高，達(dá)到71.6%，處理40 min后成活率為70.4%，50 min的成活率為68.3%。而對櫻桃砧木馬哈利離體莖尖的超低溫保存研究結(jié)果表明PVS3效果較好[17]。不同植物所用冰凍劑的作用時(shí)間以及濃度等都需要深入研究。

2.4 凍存方法

藥用植物超低溫保存凍存方法有兩步降溫法、逐步冷凍法、干燥凍存法、脫水凍存法、玻璃化法、包埋玻璃化法等。各種冷凍方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在保存實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)根據(jù)不同材料來確定冷凍方法。如對菊花莖尖來說，最適宜的方法可能是小液滴快速冷凍法，而甘薯最適宜的超低溫保存方法是玻璃化法。

2.5 化凍方法

據(jù)目前的研究來看，大多數(shù)藥用植物超低溫保存材料選擇快速化凍效果較好，化凍過程中隨著溫度的升高細(xì)胞內(nèi)易形成二次結(jié)冰。冰晶最易在-50～-10 ℃時(shí)形成，此時(shí)如果解凍速度太慢，細(xì)胞內(nèi)更多的自由水會(huì)發(fā)生重結(jié)晶，從而加大對細(xì)胞的損傷。選擇適當(dāng)?shù)慕鈨龇椒商岣叱蜏乇４嫠幱弥参锏拿劝l(fā)率和復(fù)蘇率。尚曉倩等[18]對超低溫保存后的牡丹花粉采用4種化凍方法，即分別采用自來水沖洗10 min、室溫(24 ℃)化凍、30 ℃溫水浴及40 ℃溫水浴解凍，結(jié)果表明30 ℃溫水浴化凍的花粉萌發(fā)率顯著高于其他幾種方式。庫車小白杏莖尖愈傷材料在室溫下解凍的成活率最低，僅為6%，而采用40 ℃水浴5 min解凍和4 ℃冰箱解凍的成活率較高，分別為90%和84%[19]。大葉黑桫欏在室溫下化凍的孢子萌發(fā)率為47.6%～65.3%，明顯高于37 ℃水浴化凍條件下的孢子萌發(fā)率[20]，而懷山藥莖尖在40 ℃化凍溫度時(shí)復(fù)蘇率最高[11]。對于超低溫保存的扁桃晚豐18號(hào)的花粉來說，最佳的化凍方式是35 ℃解凍70 s，花粉萌發(fā)率高達(dá)63.09%[21]。

3 藥用植物超低溫保存現(xiàn)狀

超低溫保存作為植物離體保存最重要的技術(shù)之一，國內(nèi)外已對數(shù)百種植物材料進(jìn)行了超低溫保存[22]。涉及保存的材料也很眾多，有原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、體細(xì)胞胚、花粉、莖尖分生組織等，甚至植株幼苗[2]。目前，中國、美國、法國、德國等也已建立植物種質(zhì)資源的超低溫保存庫，對農(nóng)作物和園林植物的材料進(jìn)行超低溫保存，并取得了較為理想的效果。但是，超低溫應(yīng)用范圍還非常有限，尤其在藥用植物的保存方面報(bào)道較少，更沒有專門的藥用植物超低溫種質(zhì)資源庫。已知超低溫保存成功的藥用植物材料有百子蓮胚性愈傷組織、大苞鞘石斛原球莖、人參叢生芽、金銀忍冬花粉及莖尖、降香黃檀種子等[23-36]，但還有很多珍稀瀕危藥用植物尚無進(jìn)行超低溫保存的報(bào)道。近年來，學(xué)者們對超低溫保存前后藥用植物材料做了一些對比研究和分析，目前的研究主要集中在材料形態(tài)[23-37]、細(xì)胞[20，36]等方面，對不同基因型藥用植物、不同保存類型材料及超低溫保存機(jī)理研究較少，偶見對保存材料進(jìn)行分子和遺傳穩(wěn)定性[1，38]考察的文獻(xiàn)，缺乏真正系統(tǒng)的深入研究。藥用植物超低溫保存常用方法和路線見圖1。

圖1 藥用植物超低溫保存常用方法和路線

4 問題與展望

超低溫保存已成為目前種質(zhì)資源保存的研究熱門技術(shù)[39-41]。大規(guī)模使用超低溫技術(shù)還存在以下問題：1)超低溫保存技術(shù)應(yīng)結(jié)合植物的種間差異性研究；2)冰凍保護(hù)劑的使用及優(yōu)化；3)化凍處理方法的研究；4)影響因素較多；5)超低溫理論化的進(jìn)一步發(fā)展。但隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展以及各學(xué)科相互借鑒和滲透，超低溫保存技術(shù)的研究將會(huì)不斷完善和深入。超低溫保存藥用植物種質(zhì)資源最主要的目的是保證其遺傳穩(wěn)定性，控制遺傳性狀的基因不發(fā)生突變，因此保存前后材料的遺傳穩(wěn)定性對比研究非常重要。對藥用植物而言，超低溫保存后復(fù)蘇材料的有效成分和藥理活性的對比研究也將是未來超低溫保存的重要考察點(diǎn)。另外，雖然理論上超低溫技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)種質(zhì)資源的“永久保存”，但由于超低溫保存技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，其保存的極限時(shí)間仍需更長的時(shí)間來驗(yàn)證。

藥用植物種質(zhì)資源多是重要的特有野生資源，其保存工作尤為重要。超低溫保存技術(shù)是現(xiàn)今最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的保存手段，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍是保護(hù)珍稀瀕危藥用植物種質(zhì)資源的必然趨勢，成立國家和地方藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存庫勢在必行。未來應(yīng)深入探究超低溫保存的原理，將超低溫保存技術(shù)與生產(chǎn)實(shí)踐有效的結(jié)合，參與藥用植物脫毒栽培、品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新工作以解決珍稀瀕危藥用植物種質(zhì)保存工作中的難題。