范 帆，張志敏，盧紅梅

(中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083)

顱腦損傷是因外力作用于頭部而造成的腦組織損傷，具有較高的病死率和致殘率[1-3]。血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生地、川芎、赤芍、桃仁、紅花、枳殼、甘草、當(dāng)歸、牛膝、桔梗、柴胡組成，該方劑具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，廣泛用于治療心腦血管病、腦外傷等[4-7]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個(gè)系統(tǒng)生物學(xué)新分支，研究在外界刺激、干擾或自身病理生理?xiàng)l件下代謝組的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[8-9]?；诂F(xiàn)代分析技術(shù)，借助于化學(xué)計(jì)量學(xué)等數(shù)據(jù)處理方法，可以從代謝組學(xué)得到多維的、復(fù)雜的數(shù)據(jù)中挖掘出隱藏的化學(xué)、生物信息，最終達(dá)到代謝組學(xué)分析研究的目的[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用前期建立的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法[12]，對(duì)假手術(shù)組和模型組大鼠血漿的代謝物進(jìn)行定性定量分析，然后以t檢驗(yàn)(t-test)、有監(jiān)督的正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)篩選出的具有顯著差異的代謝物為潛在標(biāo)志物，并觀察其在治療組中的時(shí)序變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QP2010型GC-MS(日本島津公司)，配Shimadzu-GL自動(dòng)進(jìn)樣器；甲醇(色譜純，Merck公司)；2-異丙基蘋果酸、甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(分析純，Sigma-Aldrich公司)。

1.2 樣本信息

實(shí)驗(yàn)樣本為大鼠顱腦損傷模型的血漿樣本，共148例。動(dòng)物模型的建立和血漿樣本的采集由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科協(xié)助完成。樣本分為治療組、模型組、假手術(shù)組。假手術(shù)組的大鼠通過手術(shù)磨除骨窗，不予打擊。模型組和治療組大鼠采用相同高度、相同質(zhì)量的自由落體打擊，從而構(gòu)建顱腦損傷大鼠模型。治療組在造模后給予血府逐淤湯灌胃，模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃，分別收集各組灌胃后第1、3、7、14 d的血漿樣本。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本預(yù)處理將100 μL血漿樣本于4 ℃解凍30 min，加入30 μL 2-異丙基蘋果酸(1 mg/mL，IS,內(nèi)標(biāo)溶液)、300 μL甲醇，渦旋30 s。4 ℃下以16 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液330 μL，常溫下用氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)尤?0 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋60 s后用封口膜封口，于70 ℃水浴反應(yīng)1 h，進(jìn)行第1次衍生反應(yīng)。加入100 μL BSTFA衍生試劑，渦旋60 s后用封口膜封口，于70 ℃水浴反應(yīng)1 h，進(jìn)行第2次衍生反應(yīng)。冷卻至室溫，取上清液，供GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析條件色譜柱為Agilent DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min升至300 ℃，保持3 min，色譜出峰時(shí)間為6.5 min，總運(yùn)行時(shí)間35.75 min。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，分流比10>∶1。載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)譜采用EI源，電子轟擊電壓70 eV；離子源溫度250 ℃，接口溫度280 ℃，檢測(cè)電壓0.9 kV，以0.2 s/scan的間隔進(jìn)行全掃描，掃描的質(zhì)量范圍(m/z)為35～800 amu。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析采用NIST/EPA/NIH質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)樣本定性。以內(nèi)標(biāo)法定量，代謝物的相對(duì)濃度用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用t檢驗(yàn)對(duì)模型組及假手術(shù)組的第1、3、7、14 d的代謝組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將具有顯著性差異的代謝物作為潛在標(biāo)志物。采用PCA和OPLS-DA觀察模型組和假手術(shù)組的總體差異。綜合變量的投影重要性指標(biāo)(VIP)及t檢驗(yàn)結(jié)果篩選生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝物的定性定量分析

對(duì)所有血漿樣本進(jìn)行GC-MS分析，采用NIST譜庫共鑒定出43種化合物，包括丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸等氨基酸，半乳糖、葡萄糖等糖類，棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類，以及尿素、磷酸等小分子代謝物(表1)，由所有測(cè)試樣本等量混合而成的質(zhì)控樣本(QC)的代表性總離子流圖見圖1。

表1 顱腦損傷模型組、假手術(shù)組血漿樣本定性定量及t檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Qualitative,quantitative analysis and t-test results of plasma samples of model group and sham group

2.2 模型組與假手術(shù)組差異代謝物篩選

將模型組與假手術(shù)組的數(shù)據(jù)上傳至Metabo Analyst 4.0平臺(tái)(Http://metaboanalyst.ca)，以p值小于0.05判斷該代謝物在兩個(gè)樣本集間是否存在顯著差異。結(jié)果顯示，13種代謝產(chǎn)物在模型組和假手術(shù)組之間存在顯著性差異(表1)，其中油酸、色氨酸、亞油酸、乳酸、棕櫚酸等11種代謝物p值小于0.001。這表明顱腦損傷會(huì)引起血漿代謝組顯著變化。

運(yùn)用PCA對(duì)第1、3、7、14 d的模型組及假手術(shù)組的代謝組進(jìn)行分析(圖2)，圖中圓圈代表假手術(shù)組樣本，方塊代表模型組樣本，置信區(qū)間為95%。由圖可見模型組和假手術(shù)組代謝的整體模式上有一定的分離趨勢(shì)，但由于存在干擾組分以及PCA的投影方向?yàn)榉讲钭畲蠓较?，PCA投影圖中組間的區(qū)分度不夠明顯。

圖1 QC樣本的GC-MS總離子流圖Fig.1 Typical total ion chromatogram(TIC) of QC plasma samplethe peak number 1-43 were the same as those in Table 1

圖2 PCA分類模型圖Fig.2 PCA classification model diagram

OPLS-DA判別分析融合了正交信號(hào)校正的干擾信息剔除能力以及偏最小二乘判別的相關(guān)信息提取能力，是代謝組學(xué)中最常用的建模方法。模型組及假手術(shù)組的OPLS-DA分析結(jié)果如圖3A所示，可見兩組有較好的分離效果。經(jīng)過200次置換檢驗(yàn)，模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象(圖3B)。OPLS-DA分析結(jié)果顯示模型組和假手術(shù)組在整體代謝模式上存在顯著差異。同時(shí)引入該模型的VIP圖探究分類的貢獻(xiàn)變量指標(biāo)。由圖4可知，有16個(gè)變量的VIP>1。選取顱腦損傷模型組與假手術(shù)組t檢驗(yàn)結(jié)果中p<0.05且OPLS-DA模型中VIP>1的代謝物為差異代謝物，最終確定乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸為兩組的差異代謝物。

2.3 第14 d的治療組與假手術(shù)組代謝組的差異倍數(shù)分析

對(duì)第14 d治療組與假手術(shù)組的代謝組進(jìn)行差異倍數(shù)分析，將差異倍數(shù)分析(FC)的閾值設(shè)為2，將對(duì)比式設(shè)為治療組/假手術(shù)組,由圖5可知，除丙二酸外，其他代謝物的log2FC均在[-1,1]區(qū)間內(nèi)且主要集中在橫軸附近(圖5)，表明除治療組中丙二酸含量顯著低于假手術(shù)組外，其他代謝物在兩組中的相對(duì)濃度無顯著性倍數(shù)差異，即第14 d治療組的代謝組整體上接近假手術(shù)組。丙二酸是三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物，治療組中丙二酸含量的降低可能與有氧代謝增強(qiáng)，中間產(chǎn)物含量降低有關(guān)。

圖4 模型組與假手術(shù)組OPLS-DA 模型變量投影重要度圖Fig.4 VIP values plot from OPLS-DA based on plasma profiling of the model vs.sham groups

圖5 第14 d的治療組與假手術(shù)組代謝組的差異倍數(shù)分析Fig.5 Fold change analysis of the treatment group and the sham group on day 14

2.4 差異代謝物在治療組中的時(shí)序變化

綜合t檢驗(yàn)結(jié)果及VIP值的重要性排序，選取乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸為生物標(biāo)志物，觀測(cè)其在治療組中的時(shí)序變化(圖6)。結(jié)果顯示，治療組中乳酸、組氨酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸的相對(duì)濃度在第1 d最高，隨著治療逐漸降低。色氨酸的相對(duì)濃度呈先減后增的趨勢(shì)，治療第3 d相對(duì)濃度最低。油酸的相對(duì)濃度呈先增后減的趨勢(shì)，相對(duì)濃度在治療第3 d最高。以上代謝物的相對(duì)濃度在治療的第14 d均與假手術(shù)組的值接近。

圖6 乳酸(A)、組氨酸(B)、色氨酸(C)、棕櫚酸(D)、亞油酸(E)、油酸(F)、硬脂酸(G)在治療組中的時(shí)序變化Fig.6 Temporal changes of lactic acid(A),histidine(B),tryptophan(C),palmitic acid(D),linoleic acid(E),oleic acid(F),stearic acid(G) in the treatment groupM:stands for the method group;T1,T3,T7,T14 were the treatment group on day 1,3,7,14;S:represents the sham group

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，顱腦損傷可引起腦組織缺血、缺氧，繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)上調(diào)，致使神經(jīng)元凋亡壞死[13]；而代謝物的相對(duì)濃度在第1 d或第3 d出現(xiàn)最值，可能與顱腦損傷后大腦廣泛存在凋亡現(xiàn)象有關(guān)，傷后第1 d即出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，傷后第3 d細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰[14]。顱腦損傷幾分鐘后，線粒體功能障礙，細(xì)胞呼吸作用受阻。為滿足能量需求，厭氧糖酵解將會(huì)增加，并導(dǎo)致乳酸積累[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠用藥第1 d血漿中乳酸濃度最高，經(jīng)血府逐瘀湯治療，乳酸濃度整體呈下降趨勢(shì)，并在第14 d與假手術(shù)組中乳酸濃度接近，這表明血府逐瘀湯可改善腦部缺血缺氧狀況，調(diào)節(jié)神經(jīng)組織能量代謝。組氨酸能夠誘發(fā)高膽固醇血癥，且其在組氨酸脫羧酶的作用下脫羧形成組胺，而組胺可舒張血管，增加血管管壁的通透性，從而導(dǎo)致局部水腫，因此組氨酸和體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)[16]。色氨酸是一種限制性氨基酸，與免疫蛋白的合成密切相關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和合成免疫球蛋白提高機(jī)體免疫力[17-18]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，色氨酸分解代謝會(huì)增強(qiáng)。同時(shí)，色氨酸也是血清素神經(jīng)遞質(zhì)的前體，血漿中色氨酸濃度的正?；瘯?huì)增加色氨酸對(duì)腦部的供應(yīng)[19]，從而為中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供能量和合成蛋白質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)[20]。由圖5C可知，炎癥發(fā)生后第3 d色氨酸含量最低，此后隨著炎癥減輕，色氨酸的相對(duì)濃度逐漸升高，再次證明血府逐瘀湯對(duì)減輕顱腦損傷引發(fā)的炎癥具有治療效果。顱腦損傷后脂代謝紊亂，血漿中脂類的增多使血液黏度增加形成血瘀。棕櫚酸是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要組成成分，研究顯示棕櫚酸與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關(guān)性[21-22]。也有研究表明硬脂酸能夠拮抗氧化應(yīng)激造成的腦片損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)治療組中棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸的含量在第1 d或第3 d最高，隨后均降低，表明血府逐瘀湯具有活血化瘀調(diào)節(jié)脂代謝的作用。

文獻(xiàn)采用氫譜核磁共振(1H NMR)技術(shù)研究了血府逐瘀湯對(duì)大鼠腦損傷的修復(fù)機(jī)理[24]，發(fā)現(xiàn)治療組血漿中乳酸、谷氨酸、膽堿的含量低于模型組，而N-乙酰天門冬氨酸、γ-羥基丁酸、肌酸的含量升高。本研究結(jié)果則顯示，治療組血漿中乳酸、組氨酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸的相對(duì)濃度逐漸降低，油酸的相對(duì)濃度先升高后降低，色氨酸的相對(duì)濃度先降低后增加。這從一定程度上反映了GC-MS和1H NMR在代謝組學(xué)研究中的互補(bǔ)性。同時(shí)也提示，對(duì)于非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，最好同時(shí)采用1H NMR和MS技術(shù)表征代謝組，以獲得覆蓋率更高的代謝物，用于標(biāo)志物的篩選，方便獲得更為全面可靠的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合t檢驗(yàn)和OPLS-DA，采用GC-MS對(duì)大鼠顱腦損傷模型組、治療組以及假手術(shù)組的血漿代謝組進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組和假手術(shù)組血漿代謝存在明顯差異，并篩選出乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸7種差異代謝物，以此為潛在標(biāo)志物，觀察7種代謝物在藥物治療組中的時(shí)序變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血府逐瘀湯治療后差異代謝物含量逐漸趨近于假手術(shù)組。研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯對(duì)顱腦損傷具有良好的治療作用，上述7種代謝物可作為生物標(biāo)志物來觀察顱腦損傷患者的恢復(fù)情況及治療效果，該研究可為血府逐瘀湯治療顱腦損傷的臨床研究提供一定的科學(xué)支撐。