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CaSR986基因多態(tài)性與能譜CT泌尿系結(jié)石成分分析及臨床特征的相關(guān)性

2020-08-24 12:44李勤祥潘愛珍徐志鋒金亞彬劉偉濤徐文鋒
關(guān)鍵詞:含鈣泌尿系能譜

李勤祥,潘愛珍,徐志鋒,金亞彬,劉偉濤,徐文鋒

(佛山市第一人民醫(yī)院,廣東 佛山 528000)

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見疾病之一,近年,隨著人們生活環(huán)境及飲食習(xí)慣的不斷改變,其發(fā)病率有上升趨勢,且復(fù)發(fā)率也相對較高,給患者造成一定的困擾[1-2]。因此尋找相關(guān)原因,探求解決辦法一直是臨床工作者關(guān)注的重點。有研究顯示,泌尿系結(jié)石復(fù)發(fā)與結(jié)石成分密切相關(guān),而后者又與基因遺傳學(xué)明顯相關(guān),但具體基因分析研究較為少見[3]。鈣敏感受體(Calcium sensing receptor,CaSR)基因位于人染色體3q13.3-21上,其編碼蛋白是一種重要的G蛋白偶聯(lián)受體,在鈣離子調(diào)節(jié)中占有重要地位[4]。CaSR基因共有7個外顯子,而CaSR986則是位于第7個外顯子中的某個單核苷酸,其主要功能是編碼細胞外域和跨膜的鈣敏感受體蛋白,可導(dǎo)致含鈣結(jié)石形成[5]。結(jié)石成分不同,其治療方法不盡相同,目前術(shù)后體外紅外光譜分析法是結(jié)石成分分析的金標準,限制了術(shù)前對結(jié)石成分的準確判斷從而影響個體化治療方案的制定,近年來能譜CT雙能量掃描可彌補此不足,可在體內(nèi)完成此項檢查,為結(jié)石成分分析提供了一個新的平臺[6-7]。本研究選取我院收治的98例泌尿系結(jié)石患者和50例健康者作為研究對象,探討CaSR986基因多態(tài)性與泌尿系結(jié)石成分及臨床特征的相關(guān)性,旨在為臨床個體化治療提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2017年7月于我院收治的98例泌尿系結(jié)石患者作為研究對象,稱為實驗組,納入標準為:①臨床表現(xiàn)、實驗室及影像學(xué)檢查均提示為泌尿系結(jié)石,且為首次診療者;②年齡在18~50歲之間,且均須經(jīng)皮腎鏡或輸尿管鏡取石術(shù)者;③術(shù)前行雙能源CT雙能量掃描,術(shù)后行紅外光譜分析者;④臨床及隨訪資料完整者。排除標準:①術(shù)前雙能CT和術(shù)后紅外光譜結(jié)果分析差異者;②懷孕者或合并泌尿系惡性腫瘤者;③期間或近半年參加相關(guān)研究者;④具有精神病史或家族史者;其中男56例,女42例;平均年齡(34.98±6.18)歲;地區(qū)分布:本地長期生活達10年者65例;其它33例。收集同期于我院進行體檢的50例健康者作為對照組,排除具有泌尿系結(jié)石家族史者;其中男28例,女22例;平均年齡(35.08±6.69)歲;地區(qū)分布:本地長期生活達10年者34例;其它16例。兩組在性別、年齡及地區(qū)分布等一般資料上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 CaSR986基因多態(tài)性檢測

1.2.1 血液標本收集及保存

囑所有患者于入組當天抽取5 mL外周靜脈血(EDTA抗凝),3 000 r/min低溫高速離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL EP管中,-80℃冰箱保存,待所有標本集齊后進行后續(xù)檢測。

1.2.2 DNA提取

參考外周血基因組DNA提取試劑盒 (美國Merck公司)操作說明書完成DNA提取,后采用GENESYSTM180紫外分光光度儀(美國Thermo Fisher公司)檢測其濃度、純度,質(zhì)量合格者進行后續(xù)實驗。

1.2.3 PCR引物設(shè)計

參考Gene Bank中CaSR基因中第7外顯子986突變位點上下游序列,使用Primer 6.0軟件完成引物設(shè)計,后由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成其合成和測序驗證,序列正確。其中上游引物序列為5’-CAGAAGGTCATCTTTGGCAGCGGCA-3’,下游引物序列為5’-TCTTCCTCAGAGGAAAGGAGTCTGG-3’。

1.2.4 PCR擴增

反應(yīng)體系:①總體積50 μL;②內(nèi)容物:4μLDNA模板、各4 μL上下游引物(0.5 μmol/L)、4 μL dNTP混合液 (200 μmol/L)、0.5 μLTaqDNA聚合酶(5U)、4 μL Mgcl2(1.5 mmol/L)及28.5 μL Buffer;③反應(yīng)條件:按95℃10 min預(yù)變性、95℃30 s變性、60℃1 min退火、72℃1 min延伸,共40個循環(huán),最后72℃ 10 min終末延伸。其中產(chǎn)物片段長度為450bp。

1.2.5 CaSR986基因多態(tài)性分析

參考PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購于美國Merck公司)操作說明書完成PCR產(chǎn)物純化和回收,后將其送至上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司測序。

1.3 結(jié)石成分分析

術(shù)前,采用寶石能譜 CT (Discovery CT 750HD,GE Healthcare)對實驗組患者體內(nèi)結(jié)石進行檢查,掃描范圍為雙腎上極至恥骨聯(lián)合水平;掃描參數(shù):GSI模式,掃描管電壓120 kVp,管電流150 mAs,探測器準直0.625 mm×64 mm,螺距0.984,球管轉(zhuǎn)速1 s/r,DFOV 12 cm,矩陣512×512。原始數(shù)據(jù)傳至GEAW 4.6工作站,由1名有多年工作經(jīng)驗的放射科醫(yī)師在GSI模式下測量所有結(jié)石的有效原子序數(shù)(Eff-Z)。選取結(jié)石最大層面手工勾畫感興趣區(qū)(ROI),盡可能包含結(jié)石,依據(jù)Eff-Z峰值和能譜曲線按照國家標準與技術(shù)研究所(NIST)已知物質(zhì)進行比較判定結(jié)石主要成分。術(shù)后,采用LIIR-20紅外光譜自動分析儀(天津藍莫德科學(xué)儀器有限公司)對實驗組患者取出結(jié)石進行成分分析。

在本研究中,主要將結(jié)石成分分為兩類:含鈣結(jié)石和非含鈣結(jié)石兩種類型。

1.4 隨訪

術(shù)后,對實驗組患者隨訪1年,每次間隔2月,主要通過電話、微信、上門和入院復(fù)查等方式進行。對疑似復(fù)發(fā)者囑其立即入院完成相關(guān)檢查,尤其強調(diào)行能譜CT復(fù)查其再發(fā)結(jié)石成分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,其中基因頻率分布采用Hardy-Weinberg平衡檢驗;計數(shù)資料用構(gòu)成比(%)描述,用χ2或Fisher精確檢驗比較;采用Pearson法分析CaSR986基因型分布與結(jié)石成分之間的關(guān)系;采用Logistic回歸法分析影響結(jié)石復(fù)發(fā)的獨立危險因素;按α=0.05的檢驗水準;以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

實驗組和對照組中發(fā)現(xiàn)CaSR986基因有AA、AS和SS三種基因型,以AA純合子基因型比較高;采用擬和優(yōu)度卡方檢驗分析其基因頻率分布,符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05),具有群體代表性。

2.2 兩組CaSR986基因多態(tài)性比較

CaSR986基因型及等位基因構(gòu)成比在實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體見表1。

2.3 實驗組結(jié)石成分分析

在本研究中,實驗組含鈣結(jié)石75例(圖1),非含鈣結(jié)石23例(圖2)。

2.4 CaSR986基因型與結(jié)石成分相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得知,含鈣結(jié)石與CaSR986 AA型呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(r=0.734,P<0.05);而含鈣結(jié)石與CaSR986其它基因型、非含鈣結(jié)石與CaSR986任何基因型均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.5 CaSR986基因型與臨床特征之間的關(guān)系

CaSR986基因型分布在結(jié)石部位、結(jié)石復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)石成分上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05):其中AA型與腎結(jié)石、AS型與膀胱結(jié)石及SS型與尿道結(jié)石相關(guān)性較大;AA型與結(jié)石復(fù)發(fā)及含鈣結(jié)石成分密切相關(guān),但在結(jié)石直徑及腎積水方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體見表2。

2.6 泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)Logistic回歸分析

將年齡、性別、結(jié)石部位、結(jié)石成分、結(jié)石直徑、腎積水情況及CaSR986基因型納入Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn):結(jié)石部位、結(jié)石成分及CaSR986基因型與泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)相關(guān)(P<0.05),在校正性別及年齡混雜因素后再次進行Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)結(jié)石成分是影響泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)。

表1 兩組CaSR986基因多態(tài)性比較

圖1,2 HDCT結(jié)石成分分析結(jié)果圖。圖1為含鈣結(jié)石(草酸鈣結(jié)石),圖2為非含鈣結(jié)石(尿酸結(jié)石)。Figure 1,2.The results of HDCT stone composition analysis.Figure 1:Calcium-containing calculus (calcium oxalate stone),Figure 2:Non-calcium stone(uric acid stone).

表2 CaSR986基因型與臨床特征之間的關(guān)系

3 討論

泌尿結(jié)石發(fā)生及復(fù)發(fā)機制截止目前仍不十分清楚,可能與環(huán)境因素、遺傳因素及個體因素等有關(guān)[8]。目前有學(xué)者認為遺傳因素在其中占有一定地位,且與結(jié)石成分相關(guān)[9]。CaSR基因可在人體各個組織中分布,以腎臟和甲狀旁腺為主,在感應(yīng)細胞外鈣離子變化后通過介導(dǎo)甲狀旁腺激素 (Parathyroid hormone,PTH)釋放和促進腎小管細胞對鈣的吸收,在保證體內(nèi)鈣平衡方面占有重要地位[10]。大部分學(xué)者認為腎臟鈣調(diào)節(jié)功能與泌尿系含鈣結(jié)石形成密切相關(guān),進一步研究發(fā)現(xiàn)CaSR是影響尿鈣重吸收的重要基因之一,基因形態(tài)不同其相關(guān)性有所差異[11-12]。在CaSR基因第7個外顯子中包含3個單核苷酸(Single nucleotide polymorphisms,SNP),分別為986S、990G和1011Q,均可導(dǎo)致含鈣結(jié)石形成,基因多態(tài)性不同,可呈現(xiàn)不同結(jié)果[13]。能譜CT是近年來醫(yī)學(xué)影像學(xué)發(fā)展史上又一突破,可在治療前大致了解結(jié)石成分,為其治療方案的選擇提供了方向,有效提高了其治愈率[14]。

本研究則主要針對CaSR986基因,探討其多態(tài)性與能譜CT泌尿系結(jié)石成分分析結(jié)果及臨床特征的相關(guān)性。本研究完成了98例泌尿系結(jié)石和50例健康體檢者外周血血清的DNA測序,發(fā)現(xiàn)兩組CaSR986基因分布符合Hardy-Weinberg定律,且均以AA純合子最為常見,這與國內(nèi)外主要觀點一致[15-16]。兩組CaSR986基因基因型及等位基因構(gòu)成比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得知,含鈣結(jié)石與CaSR986 AA型呈現(xiàn)明顯正相關(guān) (r=0.734,P<0.05),提示含鈣結(jié)石形成與CaSR986基因密切相關(guān),其具體調(diào)控機制未在本實驗中得到探討,有待后續(xù)繼續(xù)研究。此外,本研究通過分析CaSR986基因型與臨床特征之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)CaSR986基因型分布在結(jié)石部位、結(jié)石復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)石成分上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示臨床工作者可通過檢測患者CaSR986 SNP,幫助發(fā)現(xiàn)隱秘部位細小結(jié)石和預(yù)測患者預(yù)后,具有一定臨床價值。

最后,本研究還進行了泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)結(jié)石成分是影響泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05),提示臨床工作者應(yīng)該關(guān)注泌尿系結(jié)石患者結(jié)石成分的準確分析,與前面結(jié)論聯(lián)合再次強調(diào)了基因多態(tài)性與寶石能譜CT聯(lián)合檢測在泌尿系結(jié)石診療及預(yù)后監(jiān)測中的重要意義。

綜上所述,寶石能譜CT可在術(shù)前分辨含鈣結(jié)石,對泌尿結(jié)石復(fù)發(fā)預(yù)測具有一定價值,與CaSR986 AA基因型密切相關(guān)。

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