黃 婧，肖艷春，陳 彪

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003

據(jù)《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒》[1]數(shù)據(jù)顯示，2017年底我國(guó)生豬存欄量為4.4×108頭，年產(chǎn)生糞污約1.6×109t. 應(yīng)用厭氧發(fā)酵技術(shù)處理畜禽糞便并實(shí)現(xiàn)資源化循環(huán)利用是目前公認(rèn)最為有效的處理方式之一[2-3]，在獲取能源物質(zhì)的同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)減少環(huán)境污染的目的[3-5]. 研究[6-7]表明，在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的水解、酸化、酸降和產(chǎn)甲烷階段中，發(fā)酵底物的不同特性決定了厭氧發(fā)酵限速步驟的不同. 豬糞中主要的大分子復(fù)雜有機(jī)物是淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素，在厭氧發(fā)酵水解過程中糖類、蛋白質(zhì)類物質(zhì)優(yōu)先被微生物利用[8-9]. 纖維素難以被微生物分解且其中的木質(zhì)素不能被厭氧發(fā)酵過程中的微生物轉(zhuǎn)化為沼氣，需要在有氧條件下被降解，纖維素的不易降解性及淀粉類的不完全降解性限制其實(shí)際甲烷產(chǎn)率的提高[10]. 因此，水解反應(yīng)成為豬糞厭氧發(fā)酵過程的限速步驟. 對(duì)厭氧發(fā)酵水解階段反應(yīng)條件的優(yōu)化不僅可以縮短水解反應(yīng)時(shí)間，還可以提高發(fā)酵原料甲烷產(chǎn)率，是研究學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn).

通過外加酶對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行預(yù)處理以促進(jìn)原料中有機(jī)物的水解是提高甲烷產(chǎn)率最為有效的方式之一. 酶具有分子量小、溶解度高、流動(dòng)性好、比微生物更容易接近底物等優(yōu)點(diǎn)，可以在一定條件下保持生物活性[11]. 目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道外源酶添加對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)水解反應(yīng)的影響效應(yīng)及其積極作用. CHEN等[12]分析了外源水解酶對(duì)處理污泥的積極效應(yīng)及影響，試驗(yàn)表明添加水解酶后污泥液相中SCOD (可溶性化學(xué)需氧量)增量顯著. HE[10]研究顯示，添加外源纖維素酶顯著促進(jìn)城市生活垃圾的厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼，其有機(jī)組分纖維素水解率可達(dá)35.2%. 許美蘭等[13]利用α-淀粉酶和蛋白酶構(gòu)成的復(fù)合酶對(duì)豬糞進(jìn)行處理后，SCOD提高了106.9%. YU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在污泥增溶酸化方面添加α-淀粉酶的效果優(yōu)于添加蛋白酶或混合酶，污泥上清液中SCOD和VFA (揮發(fā)性脂肪酸)濃度分別提高了78.2%和129.6%. Ellenrieder等[15]采用機(jī)械和酶相結(jié)合的處理方式，對(duì)玉米和禾本科青貯飼料進(jìn)行水解促使VFA濃度提高，并獲得較高的沼氣產(chǎn)氣量. 上述研究主要關(guān)注外加酶對(duì)厭氧發(fā)酵過程中有機(jī)物水解產(chǎn)物的促進(jìn)作用，關(guān)于聯(lián)合投加纖維素酶和α-淀粉酶促進(jìn)有機(jī)物厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中酶的添加量、添加比例及其相互作用的研究較為鮮見.

該研究采用序批式厭氧發(fā)酵方式，以豬糞為發(fā)酵原料，開展外源纖維素酶和α-淀粉酶對(duì)厭氧發(fā)酵影響的研究，從厭氧發(fā)酵水解和產(chǎn)酸階段產(chǎn)物〔如多糖、TVFAs(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的統(tǒng)稱)等〕的變化規(guī)律角度，應(yīng)用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Gompertz模型擬合探析外源酶對(duì)厭氧發(fā)酵過程甲烷產(chǎn)率的影響效應(yīng)，以期提高畜禽糞污等大分子有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵的生物產(chǎn)甲烷效率(BDA)，有效提升厭氧發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用水平.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和裝置

鮮豬糞取自福建省某養(yǎng)殖公司，接種物取自常年正常運(yùn)行的沼氣工程厭氧發(fā)酵裝置. 豬糞及接種物成分組成如表1所示. α-淀粉酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，酶活 4 000 U/g；纖維素酶購(gòu)自夏盛生物科技有限公司，酶活 10 000 U/g. 試驗(yàn)采用升流式厭氧污泥床(UASB)工藝，裝置示意如圖1所示.

1.2 試驗(yàn)方案及測(cè)定方法

表1 豬糞及接種物的成分

試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)CK (對(duì)照)組、1個(gè)空白組和5個(gè)試驗(yàn)組，每組取豬糞 1 225 g，以未添加外源酶的處理為CK，以只添加接種物與蒸餾水的處理為空白組，各試驗(yàn)組外源酶添加量參照文獻(xiàn)[13,16]，具體如表2所示. 各試驗(yàn)組先加入纖維素酶，攪拌均勻后在100 r/min、45 ℃恒溫水浴搖床中振蕩處理16 h，調(diào)節(jié)水浴搖床升溫至50 ℃再加入α-淀粉酶振蕩處理4 h，待冷卻至常溫后每組接入1 L的接種物，經(jīng)調(diào)配后發(fā)酵料液總體積為5 L〔不足部分用蒸餾水補(bǔ)足，TS(總固體)含量約為8%〕，此時(shí)各試驗(yàn)組料液pH有略微差異，pH為7.0±0.1，料液通過蠕動(dòng)泵導(dǎo)入U(xiǎn)ASB發(fā)酵裝置，進(jìn)料結(jié)束后向發(fā)酵裝置中通N2保持10 min以保證厭氧環(huán)境，調(diào)節(jié)裝置溫度為35 ℃. 厭氧發(fā)酵過程中每日定時(shí)測(cè)定沼氣產(chǎn)氣量、φ(甲烷)及TVFAs濃度，在厭氧發(fā)酵前、后分別取樣測(cè)定多糖濃度.

豬糞及接種物的TS、VS (揮發(fā)性固體)含量采用差重法測(cè)定[17]；C、H、O、N、S元素含量采用元素分析儀(Vario EL III，Elementar，德國(guó))測(cè)定[18]；沼氣日產(chǎn)氣量使用濕式流量計(jì)(LML-1，長(zhǎng)春汽車濾清器有限責(zé)任公司)測(cè)定；多糖濃度的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法[9]；沼氣中φ(甲烷)和TVFAs濃度測(cè)定采用氣相色譜法[19].

注：1—三相分離器；2—水封瓶；3—?dú)怏w流量計(jì)；4—出水口；5—取樣口；6—水泵；7—蠕動(dòng)泵；8—恒溫水浴箱；9—廢水進(jìn)水池.圖1 UASB發(fā)酵裝置示意Fig.1 Schematic drawing of the UASB fermentation reactor

表2 各組添加的酶量

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1發(fā)酵原料理論產(chǎn)甲烷潛力值

目前，發(fā)酵原料理論產(chǎn)甲烷潛力值的計(jì)算是通過分析物料中的C、H、O、N、S元素含量進(jìn)行估算，碳水化合物、蛋白質(zhì)等有機(jī)物用CxHyOzNnSs表示，若完全生物降解轉(zhuǎn)換為CH4和CO2，其降解過程可用式(1)估算發(fā)酵原料的理論產(chǎn)甲烷潛力值(Xe)[20-21]. 該研究中的甲烷產(chǎn)率是基于豬糞中VS含量計(jì)算.

(1)

式中：Xe為發(fā)酵原料的理論產(chǎn)甲烷潛力值，mL/g；x、y、z、n、s分別為發(fā)酵原料C、H、O、N、S元素含量與C、H、O、N、S元素相對(duì)原子質(zhì)量的比值(取整數(shù)).

1.3.2發(fā)酵底物產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)

應(yīng)用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Gompertz模型擬合厭氧發(fā)酵過程并計(jì)算動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)[22]，根據(jù)決定系數(shù)R2對(duì)模型的擬合度進(jìn)行比較.

一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型：

Xt=X∞[1-exp(-kt)]

(2)

式中：Xt為t時(shí)刻豬糞甲烷產(chǎn)率，mL/g；X∞為整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)豬糞甲烷產(chǎn)率，mL/g；k為反應(yīng)速率常數(shù)，d-1.

Gompertz模型[23]：

(3)

式中：Rm為產(chǎn)甲烷速率，mL/(g·d)；λ為遲滯時(shí)間，d.

1.3.3發(fā)酵底物生物產(chǎn)甲烷效率

以不同時(shí)段甲烷累積產(chǎn)量與整個(gè)發(fā)酵周期甲烷總產(chǎn)量的比值表示發(fā)酵過程甲烷產(chǎn)率比(MPR)[24]. 以厭氧發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)際甲烷產(chǎn)率與理論甲烷產(chǎn)率的比值表示底物的生物產(chǎn)甲烷效率(BDA)，計(jì)算公式[24]：

BDA=(Xt/Xe)×100%

(4)

1.3.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析(不同試驗(yàn)組之間的多重比較采用LSD法)，采用Origin 9.1軟件進(jìn)行繪圖及方程擬合. 對(duì)照組和試驗(yàn)組的沼氣產(chǎn)氣量、φ(甲烷)和TVFAs濃度的試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)多糖的影響

由圖2可見，與CK組相比，經(jīng)酶處理后(即厭氧發(fā)酵前)各試驗(yàn)組發(fā)酵底物中的多糖濃度均有提高(P<0.05)，多糖濃度最大值(4 917 mg/L)出現(xiàn)在纖維素酶與α-淀粉酶配比為0∶1的試驗(yàn)組，其次出現(xiàn)在纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組(4 494 mg/L)，分別比CK組增加了196.0%、171.0%，表明在總添加量一定的條件下，多糖濃度與α-淀粉酶的添加量成正比. 已有研究[25]表明，在底物濃度一定的條件下，酶濃度較低時(shí)酶促反應(yīng)速率與酶濃度成正比，隨酶濃度的增加酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值，這時(shí)反應(yīng)體系中的酶已全部和底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，如再增加酶對(duì)酶促反應(yīng)速率影響不大. 研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，豬糞干物質(zhì)中碳水化合物占比為19.9%～34.7%，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素占比為8.9%～18.8%，發(fā)酵底物中淀粉含量高于纖維素. 結(jié)果表明，當(dāng)兩種酶的總添加量為40 mg/g時(shí)，纖維素酶的添加閾值為10 mg/g. 唐治等[16]發(fā)現(xiàn)，外加纖維素酶促進(jìn)剩余污泥水解的最適投加量為20 mg/g，最適纖維素酶添加量的不同是發(fā)酵底物的元素組成不同導(dǎo)致的. 厭氧發(fā)酵后各試驗(yàn)組的多糖濃度均低于CK組(P<0.01)，多糖濃度最小值(586 mg/L)出現(xiàn)在纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組，僅為CK組的55.4%. 在兩種酶總添加量為40 mg/g時(shí)，α-淀粉酶的添加閾值為30 mg/g. 許美蘭等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-淀粉酶的添加量超過30 mg/g時(shí)，酶促水解效應(yīng)下降，與該研究結(jié)果一致. YANG等[21]發(fā)現(xiàn)，蛋白酶和淀粉酶的添加量與SCOD/TCOD(溶解性化學(xué)需氧量與總化學(xué)需氧量之間的比值，下同)、VSS (揮發(fā)性懸浮固體)的降解率均成正比，達(dá)到平衡時(shí)復(fù)合酶的加入劑量為6%. 綜上，纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3時(shí)對(duì)發(fā)酵底物的生物質(zhì)降解效果最佳.

圖2 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)多糖濃度變化的影響Fig.2 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variations of polysaccharide content

2.2 纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)TVFAs的影響

圖3 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)TVFAs濃度變化的影響Fig.3 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variations of TVFAs concentration

厭氧發(fā)酵過程各試驗(yàn)組TVFAs濃度變化如圖3所示. 由圖3可見，各試驗(yàn)組與CK組的變化規(guī)律一致，均呈先升后降，最后趨于平穩(wěn)的特征. CK組在第3天達(dá)到產(chǎn)酸高峰(TVFAs濃度為 7 030 mg/L). 纖維素酶與α-淀粉酶配比為0∶1、1∶1、1∶3的試驗(yàn)組均比CK組提前1 d達(dá)到產(chǎn)酸高峰，其中，配比為0∶1試驗(yàn)組的產(chǎn)酸峰值最大(8 986 mg/L)，比CK組提高了27.8%；其次是配比為1∶3的試驗(yàn)組(8 666 mg/L)，比CK組提高了23.3%. 在發(fā)酵前5 d，各試驗(yàn)組TVFAs濃度與多糖濃度的變化規(guī)律一致，產(chǎn)酸峰值與CK組相比均有提高(P<0.05)，這是由于前期添加的酶促進(jìn)了有機(jī)物水解，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中多糖濃度增加，水解產(chǎn)生的多糖等小分子有機(jī)物被產(chǎn)酸細(xì)菌吸收至胞體內(nèi)進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生以短鏈脂肪酸為主的簡(jiǎn)單有機(jī)物并分泌到胞外[28]，系統(tǒng)中的短鏈脂肪酸(即TVFAs)濃度隨之增加，因此TVFAs濃度與多糖濃度成正比.

隨著厭氧發(fā)酵過程的進(jìn)行，各試驗(yàn)組在20 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，至發(fā)酵結(jié)束各試驗(yàn)組的TVFAs累積量均低于CK組，TVFAs累積量依次為1∶3試驗(yàn)組<1∶1試驗(yàn)組<0∶1試驗(yàn)組<3∶1試驗(yàn)組<1∶0試驗(yàn)組

在發(fā)酵起始階段纖維素酶與α-淀粉酶配比為0∶1 時(shí)的產(chǎn)酸高峰比配比為1∶3時(shí)略高，但在厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)，配比為0∶1的TVFAs累積量反而高于配比為1∶3的累積量，該結(jié)果與2.1節(jié)中厭氧發(fā)酵前后多糖濃度的變化規(guī)律一致. 當(dāng)配比為0∶1時(shí)，雖然C/N提高了，但其有機(jī)物水解速率過快且大于產(chǎn)甲烷速率，導(dǎo)致TVFAs有一定積累；當(dāng)配比為1∶3時(shí)，C/N適合厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物菌群的需求，其水解速率與產(chǎn)甲烷速率達(dá)到較佳的平衡狀態(tài). 綜上，纖維素酶與α-淀粉酶的最佳配比為1∶3.

2.3 纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)沼氣產(chǎn)氣量的影響

由圖4可見：在厭氧發(fā)酵進(jìn)程中，沼氣日產(chǎn)氣量總體呈先升后降的趨勢(shì)，CK組產(chǎn)氣高峰分別出現(xiàn)在第4天、第9天、第16天；除纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組在第6天出現(xiàn)1個(gè)產(chǎn)氣高峰外(峰值期比CK組提前3 d)，其他試驗(yàn)組均出現(xiàn)3個(gè)產(chǎn)氣高峰(峰值期比CK組提前1～2 d)，這與相關(guān)研究結(jié)果[3]一致. 纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組日產(chǎn)氣峰值最大(14 090 mL)，比CK組(11 710 mL)增加了20.3%.

圖4 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)沼氣日產(chǎn)氣量變化的影響Fig.4 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variation of daily biogas production

2.2節(jié)分析顯示，酶對(duì)各試驗(yàn)組的TVFAs峰值有促進(jìn)作用，各試驗(yàn)組TVFAs產(chǎn)酸高峰的提前到達(dá)促使沼氣日產(chǎn)氣量峰值的提前到達(dá)，TVFAs濃度的提高促進(jìn)了產(chǎn)甲烷路徑中合成甲烷前體物質(zhì)(包括乙酸及CO2、H2等)濃度的提升，水解產(chǎn)酸階段時(shí)間縮短，接種物及發(fā)酵體系中的產(chǎn)甲烷菌將TVFAs較快地轉(zhuǎn)化為甲烷，使其較快達(dá)到產(chǎn)氣峰值. 各試驗(yàn)組沼氣產(chǎn)氣峰值均高于CK組，而后產(chǎn)氣速率下降，并接著出現(xiàn)下一個(gè)產(chǎn)氣高峰，這是因?yàn)槿菀捉到獾牡孜锉幌暮?，水解性?xì)菌不得不利用較難降解的纖維素等物質(zhì)[7]，但發(fā)酵原料中可降解的纖維素含量低于淀粉含量，因此后期產(chǎn)氣峰值不如前期. 纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組只在前期出現(xiàn)1個(gè)產(chǎn)氣高峰，這是由于添加的纖維素酶在厭氧發(fā)酵前就已將物料中可降解的大部分纖維素降解. WANG等[11]使用牛糞和玉米秸稈共同厭氧發(fā)酵時(shí)，通過添加水解酶使其日產(chǎn)氣量峰值期提前. 因此，沼氣日產(chǎn)氣量變化與TVFAs濃度變化呈顯著正相關(guān)[31]，酶活性與水解產(chǎn)酸時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[19]，纖維素酶和α-淀粉酶的適量添加有利于沼氣產(chǎn)氣峰值的提前到達(dá)及產(chǎn)氣速率的提高.

圖5反映了各試驗(yàn)組的累積沼氣產(chǎn)氣量變化規(guī)律，各試驗(yàn)組間累積沼氣產(chǎn)氣量差異顯著(P<0.01). 由圖5可見：纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組累積沼氣產(chǎn)氣量最大(187 688 mL)，比累積沼氣產(chǎn)氣量最小的CK組(151 930 mL)提高了23.5%；配比為3∶1、1∶0試驗(yàn)組的累積沼氣產(chǎn)氣量分別比CK組分別提高了11.3%、7.3%. 結(jié)果表明：添加纖維素酶與α-淀粉酶對(duì)累積沼氣產(chǎn)氣量有不同程度的促進(jìn)作用，其中，兩種酶單獨(dú)投加均能促進(jìn)累積沼氣產(chǎn)氣量的提高，單一添加α-淀粉酶比單一添加纖維素酶的促進(jìn)效果顯著；添加兩種酶比添加單一酶的促進(jìn)效果顯著，當(dāng)纖維素酶與α-淀粉酶配比由1∶3逐步提至3∶1 時(shí)，其累積產(chǎn)氣量反而下降.

圖5 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)累積沼氣產(chǎn)氣量的影響Fig.5 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to cumulative amount of biogas production

李建昌等[7]通過添加α-淀粉酶和γ-淀粉酶對(duì)豬糞進(jìn)行預(yù)處理，采用玻璃試劑瓶作為厭氧發(fā)酵裝置使累積產(chǎn)氣量提高了14.71%，而單一添加α-淀粉酶使累積產(chǎn)氣量提高了14.09%，兩種淀粉酶的復(fù)合增效作用并不顯著，可能與這兩種酶均屬于同質(zhì)性酶類且采用的厭氧發(fā)酵工藝不同有關(guān). LUO等[32]發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶在污泥水解過程的水解常數(shù)隨溫度(在40～70 ℃之間)升高而增大，50 ℃時(shí)的水解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型且動(dòng)力學(xué)常數(shù)值最大. HE[10]研究纖維素酶預(yù)處理城市生活垃圾發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)氣相關(guān)的系數(shù)相對(duì)空白可提高75.08%. 該研究中累積沼氣產(chǎn)氣量有大幅提升，與試驗(yàn)中增加了水解酶的種類、降低了酶的作用溫度、延長(zhǎng)了酶的作用時(shí)間以及采用UASB厭氧發(fā)酵工藝有關(guān). 許美蘭等[13]利用淀粉酶和蛋白酶兩種復(fù)合酶對(duì)豬糞進(jìn)行預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復(fù)合酶處理的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，SCOD提高了106.9%. SCOD包含了酶催化反應(yīng)過程中的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物，用該指標(biāo)表征兩種酶復(fù)合增效顯著，復(fù)合酶的較佳水解溫度和時(shí)間分別為45 ℃、6 h，該試驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了酶種類、作用溫度對(duì)水解過程起著重要作用，適宜條件對(duì)沼氣產(chǎn)氣量促進(jìn)效應(yīng)顯著.

2.4 動(dòng)力學(xué)分析

2.4.1配比對(duì)甲烷產(chǎn)率的影響

圖6為沼氣中φ(甲烷)變化曲線圖，φ(甲烷)的變化是厭氧發(fā)酵不同階段中非產(chǎn)甲烷菌與產(chǎn)甲烷菌之間相互平衡協(xié)同作用的結(jié)果. 由圖6可見：在厭氧發(fā)酵進(jìn)程中，各試驗(yàn)組φ(甲烷)均呈先快速增加而后趨于穩(wěn)定，末期逐步降低的特征. CK組的φ(甲烷)穩(wěn)定期為23 d (第4～26天)，φ(甲烷)穩(wěn)定在60.4%～70.4%之間；纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3 試驗(yàn)組在厭氧發(fā)酵周期內(nèi)的φ(甲烷)平均值最佳，穩(wěn)定期為27 d (第3～29天)，穩(wěn)定期長(zhǎng)于CK組，φ(甲烷)穩(wěn)定在61.7%～70.8%之間，比CK組略有增加. 試驗(yàn)組添加的酶使厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中可利用的碳源物質(zhì)增加，促使TVFAs和pH發(fā)生變化，提高了系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定性，乙酸產(chǎn)甲烷途徑、氫還原CO2產(chǎn)甲烷途徑中碳物質(zhì)濃度隨之增加，乙酸作為甲烷形成的重要前體物質(zhì)[33]，其含量的提高促進(jìn)了終產(chǎn)物甲烷含量的提升.

圖6 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)沼氣中φ(甲烷)變化的影響Fig.6 The effect of different ratio of cellulase and α-amylase to variation of methane volume fraction in biogas

由表3可見：CK組的甲烷產(chǎn)率為315.4 mL/g，與杜連柱等[24]研究結(jié)果(326 mL/g)相近. 纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3時(shí)甲烷產(chǎn)率最高(392.1 mL/g)，比CK組提高了24.3%；兩種酶比單一酶處理的甲烷產(chǎn)率有所增加，相較CK組，配比為1∶3時(shí)比配比為1∶0 時(shí)的甲烷產(chǎn)率(336.9 mL/g)增加了17.5%；單一α-淀粉酶處理(配比為0∶1)的甲烷產(chǎn)率比單一纖維素酶處理(配比為1∶0)增加了10.1%.

各試驗(yàn)組甲烷產(chǎn)率差異性主要原因是：①豬糞中淀粉含量比纖維素高，所以單一α-淀粉酶處理比單一纖維素酶處理的甲烷產(chǎn)率高；②兩種酶比單一酶處理的甲烷產(chǎn)率高，豬糞中的纖維素是難降解物質(zhì)，先采用外加纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理，使發(fā)酵原料在有氧環(huán)境中水解，有利于促進(jìn)水解反應(yīng)的發(fā)生及水解時(shí)間的縮短，而且纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶并非專一性酶，其可以作用于發(fā)酵原料中的β-1，4-糖苷鍵，提高水解效率，兩種酶聯(lián)合水解過程中產(chǎn)生的寡糖、纖維二糖、麥芽糖、糊精等中間產(chǎn)物，增加了可利用碳源的濃度，為可以利用低聚糖的微生物提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能源，促進(jìn)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸微生物的生長(zhǎng)繁殖并在較短時(shí)間內(nèi)將低分子糖類轉(zhuǎn)化為乙酸，產(chǎn)甲烷菌可以更高效、快速地將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷，促進(jìn)甲烷產(chǎn)率提高；③α-淀粉酶添加量超過30 mg/g時(shí)，甲烷產(chǎn)率反而下降(配比為0∶1試驗(yàn)組比1∶3試驗(yàn)組的甲烷產(chǎn)率低)，當(dāng)添加的α-淀粉酶超過一定量時(shí)可能導(dǎo)致過快的有機(jī)物水解及后續(xù)過快的有機(jī)酸產(chǎn)生，一旦有機(jī)酸產(chǎn)生速率超過產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行甲烷轉(zhuǎn)化的速率，有機(jī)酸的過量積累將抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，最終導(dǎo)致甲烷產(chǎn)率的下降；④纖維素酶添加量超過10 mg/g時(shí)，甲烷產(chǎn)率反而下降(配比為1∶1試驗(yàn)組較1∶3試驗(yàn)組的甲烷產(chǎn)率低)，這是由于隨著纖維素酶活的增加，水解產(chǎn)物纖維二糖的濃度逐漸升高，當(dāng)纖維二糖的濃度超過臨界值則會(huì)產(chǎn)生反饋抑制，抑制纖維素酶的酶活[34-35]，水解反應(yīng)速率減緩，水解產(chǎn)物減少，相應(yīng)的甲烷產(chǎn)率降低. 綜上，纖維素酶與α-淀粉酶的添加量及添加比例對(duì)甲烷產(chǎn)率的提高尤為重要.

2.4.2甲烷產(chǎn)率動(dòng)力學(xué)模型

試驗(yàn)采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Gompertz模型擬合不同試驗(yàn)組的厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程，表3中列出了兩種模型的擬合參數(shù).

由表3可見，Gompertz模型的決定系數(shù)R2均大于 0.997 8，擬合精確度高，而且甲烷產(chǎn)率的擬合值與實(shí)測(cè)值接近，最大差值僅為-1.8%，說明該模型可以較為準(zhǔn)確地反映各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷過程. 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的決定系數(shù)R2均小于 0.970 3，且擬合值與實(shí)測(cè)值偏差超過24.0%，說明不適合用該模型擬合厭氧發(fā)酵過程.

表3 擬合方程對(duì)各試驗(yàn)組甲烷產(chǎn)率曲線的擬合結(jié)果

Gompertz模型中，CK組的遲滯期最長(zhǎng)(2.29 d)，纖維素酶與α-淀粉酶配比為0∶1試驗(yàn)組的遲滯期最短(1.08 d)，比CK組縮短了52.8%；纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3試驗(yàn)組的遲滯期次之(1.41 d)，比CK組縮短了38.4%，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述水解階段多糖濃度的變化規(guī)律，在總添加量一定的條件下，隨著α-淀粉酶添加量的增加，遲滯期隨之縮短. 該試驗(yàn)結(jié)果是由于添加的酶促進(jìn)物料中顆粒有機(jī)物水解為小分子，產(chǎn)生更多的表面積供微生物附著，而且隨著酶濃度和吸附位點(diǎn)可用性的增加而增加[32]，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量急劇增多，物料中α-淀粉酶作用專一性位點(diǎn)數(shù)量相對(duì)較多，α-淀粉酶的水解速率優(yōu)于纖維素酶. CK組的反應(yīng)速率最慢〔26.18 mL/(g·d)〕，纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3試驗(yàn)的反應(yīng)速率最快〔32.95 mL/(g·d)〕，比CK組提高了25.8%. 因此，α-淀粉酶和纖維素酶的添加不僅縮短了遲滯期，還提高了反應(yīng)速率，其中纖維素酶與α-淀粉酶的最佳配比為1∶3.

研究[22,26]發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同有機(jī)廢棄物的厭氧發(fā)酵過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，Gompertz模型可以較好地反映各原料的產(chǎn)甲烷過程. 而徐文倩等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，接種比越大，含固率越高，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的擬合度越高. 杜連柱等[24]發(fā)現(xiàn)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型可以較好地?cái)M合TS含量為3%和7.5%時(shí)的厭氧發(fā)酵過程. 因此，在TS含量較低時(shí)，接種物與發(fā)酵原料的比值大于3∶1時(shí)采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型可以較好地?cái)M合厭氧發(fā)酵過程，其他條件下的厭氧發(fā)酵過程則較適宜采用Gompertz模型進(jìn)行擬合.

2.4.3纖維素酶與α-淀粉酶協(xié)同效應(yīng)分析

纖維素酶與α-淀粉酶不同配比協(xié)同效應(yīng)如表4所示. 實(shí)測(cè)值為各試驗(yàn)組實(shí)際甲烷產(chǎn)率，預(yù)測(cè)值是基于0∶1試驗(yàn)組與1∶0試驗(yàn)組的實(shí)測(cè)值，并按纖維素酶與α-淀粉酶不同配比計(jì)算得出的甲烷產(chǎn)率[37]. 由表4可見，不同纖維素酶與α-淀粉酶配比存在不同程度的協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3時(shí)，兩種酶協(xié)同效應(yīng)顯著，增率為8.4%.

表4 不同纖維素酶與α-淀粉酶配比協(xié)同效應(yīng)分析

2.5 纖維素酶與α-淀粉酶配比對(duì)生物產(chǎn)甲烷效率的影響

各試驗(yàn)組厭氧發(fā)酵過程部分時(shí)間點(diǎn)的MPR和BDA如表5所示，其可作為確定HRT(水力停留時(shí)間)的重要依據(jù). 該研究中以MPR等于90%表示厭氧發(fā)酵反應(yīng)過程結(jié)束[24]. 由表5可見，CK組和各試驗(yàn)組的厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)間分別為17.9、15.8、16.5、16.3、15.4和16.8 d，纖維素酶與α-淀粉酶配比1∶3試驗(yàn)組的HRT時(shí)間最短，比CK組縮短了2.5 d. 在實(shí)際應(yīng)用中，HRT的縮短意味著發(fā)酵反應(yīng)器有更高的有效容積利用率，利于成本降低.

根據(jù)發(fā)酵原料元素分析結(jié)果可知，豬糞的化學(xué)組成為C270H485O141N18S2，通過式(1)計(jì)算得出豬糞的理論產(chǎn)甲烷潛力值為552.3 mL/g，由此計(jì)算原料在不同發(fā)酵時(shí)間的BDA(見表5)，該值為衡量原料甲烷轉(zhuǎn)化是否徹底的重要參數(shù). 適量添加α-淀粉酶或纖維素酶有明顯的促進(jìn)作用. 反應(yīng)結(jié)束時(shí)，纖維素酶與α-淀粉酶配比為0∶1、1∶0試驗(yàn)組的BDA值與CK組相比分別提高了16.9%、6.8%，說明添加單一α-淀粉酶對(duì)厭氧發(fā)酵過程生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的影響比添加單一纖維素酶更為顯著，這是由于豬糞中的纖維素屬于結(jié)構(gòu)性碳水化合物，不容易被降解. 研究[38]發(fā)現(xiàn)，厭氧發(fā)酵水解過程中纖維素一級(jí)動(dòng)力學(xué)水解常數(shù)為0.011～0.0139 d-1，而碳水化合物一級(jí)動(dòng)力學(xué)水解常數(shù)為0.025～0.200 d-1，纖維素水解常數(shù)比碳水化合物低，水解速率慢，雖然添加了纖維素酶促進(jìn)纖維素水解，但發(fā)酵原料中纖維素的含量也低于碳水化合物含量，降解底物有限，相應(yīng)的BDA值較低. 纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組在第13天的BDA值已超過CK組第35天的值，在第35天時(shí)其BDA值為71.0%，較CK組提高了24.3%，說明兩種酶協(xié)同效應(yīng)顯著.

表5 厭氧發(fā)酵過程部分時(shí)間點(diǎn)的甲烷產(chǎn)率比和生物產(chǎn)甲烷效率

3 結(jié)論

a) 采用UASB厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼裝置，適量添加的纖維素酶和α-淀粉酶對(duì)豬糞進(jìn)行預(yù)處理有利于促進(jìn)有機(jī)物的水解. 在pH為7.0、溫度為35 ℃下厭氧發(fā)酵，水解階段的多糖濃度與產(chǎn)酸階段的TVFAs濃度變化規(guī)律一致. 兩種酶總添加量為40 mg/g，且α-淀粉酶添加量不超過30 mg/g時(shí)，α-淀粉酶添加量與甲烷產(chǎn)率呈正相關(guān)；當(dāng)纖維素酶添加量超過10 mg/g 時(shí)，纖維素酶添加量與甲烷產(chǎn)率呈負(fù)相關(guān).

b) 甲烷產(chǎn)率與多糖濃度、TVFAs濃度的變化規(guī)律有一定的相關(guān)性，但也存在差異性. 纖維素酶與α-淀粉酶配比為1∶3的試驗(yàn)組，其水解速率與產(chǎn)甲烷速率達(dá)到較佳的平衡狀態(tài)，最早達(dá)到產(chǎn)氣高峰(第6天)，甲烷產(chǎn)率最高(392.1 mL/g)，且生物產(chǎn)甲烷效率最佳(71.0%)，HRT最短(15.4 d)，兩種酶協(xié)同效應(yīng)顯著.

c) 該研究尚未考慮pH和溫度對(duì)外加酶促進(jìn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響，后續(xù)可進(jìn)一步開展相關(guān)研究.