楊柳，查云飛，陳翩翩，柳柏玉，閆玉辰，王焰

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以胰島素抵抗和/或胰島素分泌缺陷為基本病理改變所引起的以高血糖為主要臨床特征的代謝異常綜合征[1]，長期糖、脂類物質(zhì)代謝異?？蓪е卵荛]塞。近年來DM合并外周動脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)發(fā)生率明顯升高[2]，嚴重肢體缺血(critical limb ischemia，CLI)時肢體動脈閉塞導致血流不能滿足靜息時肢體代謝需要的狀態(tài)，是PAD的最晚期階段[3]，是截肢的嚴重危險因素[4]。

近年來研究結(jié)果顯示糖尿病骨病可能是一種慢性骨髓微血管并發(fā)癥[5]，Hu等[6]首次運用動態(tài)對比增強磁共振成像(DCE-MRI)對兔糖尿病模型的椎體骨髓進行定量分析，結(jié)果顯示動態(tài)增強參數(shù)可以評價糖尿病早期骨髓微血管滲透性和血流灌注變化。影像組學(radiomics)采用高通量特征提取算法，通過對病灶的分割、特征數(shù)據(jù)提取、數(shù)據(jù)庫的建立和個體化數(shù)據(jù)分析來逐步實現(xiàn)圖像的定量分析[7]。紋理分析(texture analysis，TA)是對圖像像素灰度值的局部特征、變化規(guī)律及其分布模式進行分析，最終對圖像的性質(zhì)、類別進行區(qū)分及歸類[8]。近年來，紋理分析在骨健康、退行性病變、創(chuàng)傷以及腫瘤的診斷和鑒別診斷、療效評估及預后預測等方面均顯示出較大應用價值[9]。本研究旨在探討基于DCE-MRI定量參數(shù)及容量轉(zhuǎn)移常數(shù)的紋理分析技術(shù)在評估兔糖尿病合并嚴重肢體缺血模型骨髓改變中的應用價值。

材料與方法

1.兔糖尿病合并嚴重肢體缺血動物模型的建立

本實驗經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有動物處置均遵循實驗動物倫理原則。選取20只健康新西蘭雄性大白兔，由武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心提供(單籠飼養(yǎng)，室溫控制在25℃)，空腹體重2.6～3.0 kg，平均(2.8±0.2) kg。所有實驗動物在適應性飼養(yǎng)1周后進行造模，造模前均禁食、不禁水12 h，測量空腹血糖，血糖值均<6.0 mmol/L，平均(5.5±0.3) mmol/L。將四氧嘧啶(Sigma公司)與0.9%的生理鹽水配制成濃度為5%的溶液，按照100 mg/kg的劑量快速經(jīng)兔的耳緣靜脈注入。48 h后，使用血糖儀(三諾安信血糖儀)測量兔外周血糖濃度，單次測量值≥14 mmol/L或兩次測量值≥11 mmol/L即認定為兔糖尿病模型造模成功。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后，復測血糖，所有實驗兔的血糖值符合糖尿病診斷標準。

將實驗兔隨機分為實驗組10只和假手術(shù)組10只，兩組間血糖值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組在糖尿病模型基礎(chǔ)上建立肢體缺血模型，操作方法：經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，劑量1.3 mL/kg，在右后肢腹股溝韌帶中點處切開皮膚，分離脂肪及筋膜層，暴露、游離股動脈，雙線結(jié)扎后從中間剪斷血管，術(shù)畢逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅切開股鞘，隨即縫合皮膚。

圖1 實驗組兔各序列圖像。a)股骨冠狀面LAVA序列MRI增強圖像，白色線條區(qū)域為手動勾畫的股骨上段ROI；b)Ktrans偽彩圖；c)Kep偽彩圖；d)Ve偽彩圖。

2.影像設(shè)備及成像方法

在造模成功后的第1、5、10、15、20和25天對所有實驗兔進行血糖檢測、數(shù)字化X線攝影及MRI檢查。

每次行MRI檢查前測量實驗兔的血糖值，并采用Shimadzu SonialVisionI G4數(shù)字化X線攝影系統(tǒng)進行檢查，掃描參數(shù)：68 kV，160 mA，8.1 ms。檢查前由一位具有5年以上工作經(jīng)驗的介入科醫(yī)師經(jīng)腹主動脈入路插入肝素浸泡的3F微導管，頭端置于腹主動脈內(nèi)，手動勻速(約2～3 mL/s)注射碘佛醇(320 mg I/mL)20 mL。

MRI檢查使用GE Discovery MR750 Plus 3.0T超導MR機和8通道膝關(guān)節(jié)專用相控陣線圈，將兔麻醉后仰臥位、足先進固定于掃描床上，行右股骨MRI平掃和增強掃描。

冠狀面FSE-T1WI參數(shù)：TR 300 ms，TE 13 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，視野160 mm×160 mm，矩陣320×288；冠狀面FSE-T2WI參數(shù)：TR 2500 ms，TE 120 ms，視野160 mm×160 mm，層厚3 mm，層間距0 mm，矩陣320×320。

DCE-MRI掃描：掃描序列為肝臟快速容積采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA)及陣列空間敏感編碼技術(shù)(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)。首先行多翻轉(zhuǎn)角LAVA序列掃描(TR 3.5 ms，TE1.6 ms，層厚3.0 mm，視野20 cm×16 cm，矩陣192×192，翻轉(zhuǎn)角為9°及12°)，每個翻轉(zhuǎn)角序列掃描一個時相(8 s)；隨后行冠狀面LAVA序列動態(tài)增強掃描(TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，層厚3.0 mm，視野20 cm×16 cm，矩陣192×192，翻轉(zhuǎn)角10°)，連續(xù)無間隔同層掃描420幀動態(tài)圖像，總計掃描35個時相，總掃描時間為4 min 31 s。在基線掃描2個動態(tài)時相之后使用雙筒高壓注射器經(jīng)兔耳緣靜脈團注釓雙胺，劑量為0.2 mmol/kg，注射流率1.0 mL/s，隨后以相同流率注射0.9%生理鹽水5 mL沖管。

3.DCE-MRI定量參數(shù)及紋理分析

采用GE Omni-Kinetics軟件對DCE-MRI掃描數(shù)據(jù)進行后處理和分析。首先對35期動態(tài)增強圖像進行3D非剛性運動校正，以降低呼吸運動偽影，然后導入兩個翻轉(zhuǎn)角(9°和12°)LAVA序列圖像，用于T1-mapping的計算，再將校正后的35期增強圖像導入。首先在兔左股動脈手動勾畫興趣區(qū)ROI，獲得時間-濃度曲線，進而確定動脈輸入函數(shù)(arterial input function，AIF)；隨后在兔右側(cè)股骨上段內(nèi)勾畫ROI，注意避開骨皮質(zhì)、骨島及血管，采用merge功能將每個層面的ROI融合為三維容積興趣區(qū)(VOI)，利用藥代動力學Extended Tofts Linear雙室模型，得到右股骨上段骨髓的血容量轉(zhuǎn)移常數(shù)(Ktrans)、速率常數(shù)(Kep)、對比劑血管外細胞外間隙(extravascular extracellular space，EES)的容積(Ve)，重復測量3次，各參數(shù)取3次測量值的平均值作為最終結(jié)果(圖1)。同時在于Ktrans圖上提取ROI內(nèi)3個類別的紋理特征共67個，包括灰度直方圖(histogram)特征29個、灰度共生矩陣(the gray-level co-occurrence matrix，GLCM)特征28個和灰度游程矩(the gray run-length matrix，GRLM)特征10個。

4.組織病理學檢查

在造模后第25天MRI檢查完成后，采用空氣栓塞法處死所有實驗兔，取股骨上段，使用4%多聚甲醛溶液進行固定、脫鈣1個月后，石蠟包埋，沿股骨縱軸方向切取4μm厚薄片，行HE染色以及免疫組化染色。免疫組化染色測量組織內(nèi)微血管密度的方法：每張切片隨機挑選至少3個視野(×200)進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，盡量保證每張照片的背景光一致。CD31表達于血管內(nèi)皮細胞，以血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。先在低倍光鏡下掃查整個切片，尋找3個血管高密度區(qū)，即“熱點”；然后在 200 倍光鏡下計數(shù)染色呈陽性的血管數(shù)，對于微血管的識別不需具備完整的管腔和紅細胞，只要有明顯的血管內(nèi)皮細胞染色、并且能與相鄰的血管、腫瘤細胞以及間質(zhì)成分相分隔，就可視為一個獨立的血管，分辨不清以及具有較厚肌層的血管不納入計數(shù)；取3個相互不連續(xù)區(qū)域的測量結(jié)果的平均值作為微血管密度(microvessel density，MVD)值。

使用Nikon Eclipse CI光學顯微鏡，在高倍鏡下(×400)選取3個獨立的相同面積區(qū)域進行觀察并拍片。應用Media Cybermetic ImagePro Plus 6軟件對圖像進行分析，測量HE染色切片中骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨小梁數(shù)量和面積(圖2)。

圖2 股骨上段病理圖。a)應用AOI工具標記骨小梁；b)使用顏色選取工具標記出所有骨小梁，即可進行骨小梁的計數(shù)和面積測量。 圖3 實驗組兔數(shù)字化X線攝影圖像。a)結(jié)扎第1天，股動脈結(jié)扎處(箭)遠端血管內(nèi)無對比劑充盈；b)結(jié)扎第25天，股動脈閉塞處遠端分支顯影(箭)，提示側(cè)支循環(huán)建立。 圖4 術(shù)后第25天兔股骨骨髓CD31免疫組化檢查，顯微鏡下(×400)可見實驗組骨髓內(nèi)微血管較假手術(shù)組明顯增多(箭)。a)實驗組；b)假手術(shù)組。 圖5 術(shù)后第25天兔股骨上段HE染色，顯微鏡下(×400)可見實驗組骨小梁分布稀疏，骨小梁的數(shù)量和面積較假手術(shù)組明顯減少。a)實驗組；b)假手術(shù)組。

5.統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，先對各參數(shù)行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，符合正態(tài)分布的參數(shù)以均數(shù)±標準差表示，不符合正態(tài)分布的參數(shù)用中位數(shù)(上、下四分位數(shù))表示。采用獨立樣本t檢驗(數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗)或者Mann-WhitneyU檢驗(數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差齊性)比較同一時間點各組間DCE-MRI參數(shù)值的差異；對不同時間點的Ktrans值的比較采用重復測量方差分析，如球形檢驗結(jié)果為P>0.05，采用多變量方差分析方法(MANOVA)進行檢驗分析。

采用獨立樣本t檢驗或者Mann-WhitneyU檢驗篩選實驗組和假手術(shù)組間差異有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)特征。采用Pearson相關(guān)分析評價骨髓微血管滲透性參數(shù)、MVD及組間差異有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)(MeanValue、MPP、sumAverage)與骨小梁數(shù)量和面積的相關(guān)性、以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.實驗動物管理的基本情況

實驗過程中實驗組及假手術(shù)組兔因麻醉、健康狀況差各死亡4只，每組余6只實驗動物。

2.數(shù)字化X線攝影檢查

在每個時間點，實驗組中股動脈造影顯示股動脈結(jié)扎處均未再通，術(shù)后25天可見結(jié)扎股動脈的遠端有側(cè)支循環(huán)形成(圖3)。

3.組織病理學

造模第25天，CD31免疫組化檢查顯示實驗組中股骨上段骨髓的MVD較假手術(shù)組明顯增高(圖4)；HE染色顯示實驗組的股骨上段骨小梁數(shù)量(Tb-N)和面積(Tb-Ar)較假手術(shù)組明顯變少(圖5)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4.DCE-MRI定量參數(shù)分析

各時間點實驗組和假手術(shù)組的DCE-MRI定量參數(shù)值和組間比較結(jié)果及組間差異有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)值見表1。兩組間各時間點的Ktrans值的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組造模成功后第1天的Ktrans值降低，之后呈升高趨勢，第25天時Ktrans值仍低于假手術(shù)組(圖6)。兩組間僅于第5天時Kep值的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而各時間點Ve值的組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖6 各時間點實驗組和假手術(shù)組中實驗兔股骨骨髓Ktrans值的變化趨勢圖。 圖7 實驗組術(shù)后第25天兔股骨上段骨髓的Ktrans值與病理檢查指標間的相關(guān)性分析散點圖。a)Ktrans值與MVD呈正相關(guān)關(guān)系；b)Ktrans值與Tb-N呈負相關(guān)關(guān)系；c)Ktrans值與Tb-Ar呈負相關(guān)關(guān)系。

圖8 術(shù)后第25天實驗組股骨上段的Tb-N與基于Ktrans圖的組間差異有統(tǒng)計學意義的3項紋理參數(shù)的相關(guān)性分析散點圖，顯示3項紋理參數(shù)與Tb-N均呈負相關(guān)關(guān)系。a)MeanValue；b)MPP；c)sumAverage。圖9 術(shù)后第25天實驗組股骨上段的Tb-Ar與基于Ktrans圖的組間差異有統(tǒng)計學意義的3項紋理參數(shù)的相關(guān)性分析散點圖，顯示3項紋理參數(shù)與Tb-Ar均呈負相關(guān)關(guān)系。a)MeanValue；b)MPP；c)sumAverage。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖7)：實驗組的股骨上段骨髓Ktrans與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.827，P<0.05)，而Kep、Ve與MVD之間均無顯著相關(guān)關(guān)系(r=0.067，P>0.05；r=0.139，P>0.05)；Ktrans與Tb-N、Tb-Ar均呈顯著負相關(guān)(r=-0.891，P<0.05；r=-0.922，P<0.05)。假手術(shù)組的股骨上段骨髓Ktrans與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.895，P<0.05)；Ktrans與Tb-N、Tb-Ar呈顯著負相關(guān)(r=-0.877，P<0.05；r=-0.814，P<0.05)。

6.基于DCE-MRI Ktrans圖的紋理分析

實驗組與假手術(shù)組之間在各時間點差異均有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)有3個，分別為像素信號平均值(MeanValue)、正像素平均值(mean value of positive pixels，MPP)和平均值總和(sumAverage)，各時間點的參數(shù)值及組間比較結(jié)果見表1。相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖8～9)，3個紋理參數(shù)均與Tb-N呈負相關(guān)(r=-0.891，P=0.0017；r=-0.891，P=0.0017；r=-0.963，P=0.002)，與Tb-Ar呈負相關(guān)(r=-0.922，P<0.05；r=-0.922，P<0.05；r=-0.972，P<0.05)。

表1 實驗組、假手術(shù)組各時間點定量參數(shù)及有意義紋理參數(shù)的比較結(jié)果

討 論

本研究首次采用基于DCE-MRI的微血管滲透性參數(shù)Ktrans來評價糖尿病合并嚴重肢體缺血兔模型早期骨髓的變化情況，實驗組造模成功后第1天Ktrans值明顯降低，之后呈升高趨勢，但Ktrans值始終低于假手術(shù)組；實驗組和假手術(shù)組各時間點之間Ktrans值的差異均有統(tǒng)計學意義；Kep值僅在術(shù)后第5天的組間差異存在顯著性意義；而各時間點Ve值的組間差異均無統(tǒng)計學意義。Ktrans值與骨髓MVD及Tb-N、Tb-Ar均具有高度相關(guān)性(P<0.05)。造模后第25天，實驗組中MeanValue、MPP和sumAverage三項紋理參數(shù)與Tb-N、Tb-Ar均呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

Ktrans值代表單位時間內(nèi)對比劑從血管進入細胞外間隙的數(shù)目，其值受到單位體積內(nèi)的血流量、毛細血管的滲透性及表面積等因素的影響[10]。在本研究中，由于結(jié)扎股動脈，會造成骨髓血流灌注急劇降低，故第1天股骨上段Ktrans值明顯降低；隨著時間推移，結(jié)扎股動脈的遠端側(cè)支循環(huán)形成，Ktrans值亦呈升高趨勢，CD31免疫組化結(jié)果也顯示第25天時實驗組中兔骨髓MVD較假手術(shù)組明顯增多，可能系實驗組中骨髓內(nèi)大量新生血管形成所致。這種改變可能與缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)密切相關(guān)，由于結(jié)扎了股動脈造成股骨骨髓缺、缺氧，在缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達是由HIF-1誘導的，VEGF促進新生血管形成[11]。HIF-1靶基因的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)通過調(diào)節(jié)基質(zhì)代謝間接促進血管新生，MMPs降解細胞外基質(zhì)，使內(nèi)皮細胞和基底膜間的連接變松弛，有利于內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和分化[12]。

Kep為對比劑從血管外-細胞外間隙(EES)反流回血管的速率，在兩組間的差異僅在術(shù)后第5天時有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在其它各時間點時均無統(tǒng)計學意義。其原因可能在于后期新生血管豐富且結(jié)構(gòu)異常、血管內(nèi)皮細胞發(fā)育不完善及血管通透性強導致對比劑回流增加，組間差異不顯著。

Ve主要反映在EES中對比劑濃度整個組織中所占百分比，Ve可反映組織內(nèi)炎癥或壞死的程度[13]。本研究中各時間點Ve值的組間均無統(tǒng)計學意義，可能由于本實驗研究中實驗周期較短，分析的是糖尿病合并嚴重肢體缺血后的早期改變，此時骨髓組織尚未出現(xiàn)明顯壞死。

Teraa等[14]首次報道嚴重肢體缺血患者骨髓MVD降低，與是否合并有糖尿病無關(guān)。在我們的研究中，實驗組中兔骨髓MVD呈代償性增高，這可能是因為我們研究的是疾病早期模型，而Teraa等的研究中實驗對象為長期穩(wěn)定模型；此外，在第25天時，實驗組的肢體骨髓灌注仍然低于假手術(shù)組，表明盡管MVD有所增高，但實驗組的血流灌注仍難以恢復至正常水平。

紋理分析通過將紋理的空間結(jié)構(gòu)差異轉(zhuǎn)化為特征灰度值的差異，可以量化不被肉眼識別的變化所產(chǎn)生的圖像異質(zhì)性[15]。本研究首次開展對糖尿病合并嚴重肢體缺血的骨髓微結(jié)構(gòu)的紋理分析，結(jié)果顯示實驗組和假手術(shù)組之間在各時間點測量值的差異均有統(tǒng)計學意義的紋理參數(shù)有3個，為MeanValue、MPP和sumAverage。MeanValue代表ROI中所有像素點的信號強度的平均值，MPP反映了圖像上正像素的平均信號強度。本研究中這兩個參數(shù)的測量值相同，可能是由于本實驗中分析的是糖尿病合并嚴重肢體缺血的早期變化，暫未出現(xiàn)負像素(如壞死區(qū))，故實驗模型中骨髓ROI全部像素點的測量值均為正值，無負值，故MeanValue和MPP數(shù)值相同，且均與Tb-Ar、Tb-N呈高度相關(guān)關(guān)系。我們推測，實驗組兔在結(jié)扎股動脈后，股骨上段血流灌注顯著降低，盡管后來有側(cè)支循壞的建立，但骨髓組織仍處于缺血、缺氧的狀態(tài)，骨髓營養(yǎng)供應不足，繼而引起骨小梁數(shù)量和面積減少。sumAverage用于測量行或列方向上圖像灰度的相似度，此紋理參數(shù)鮮見報道，在本實驗模型中，可能由于肢體動脈閉塞致血流不能滿足代謝需要，骨的微結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生改變，骨小梁稀疏且厚薄不一，導致圖像行列的灰度值差異較大。Ktrans與Tb-N和Tb-Ar也呈高度相關(guān)，也驗證了我們提出的假說：骨髓微血管灌注及滲透性影響到骨小梁微結(jié)構(gòu)，最終導致了骨髓紋理參數(shù)值出現(xiàn)變化。

本研究的局限性：第一，本研究中實驗樣本量較小，糖尿病合并嚴重肢體缺血股骨骨髓微結(jié)構(gòu)及微血管通透性的變化機制仍需大樣本研究予以證實；第二，實驗中建立的動物模型與臨床上糖尿病合并肢體嚴重缺血患者的自然病程之間存在差異；第三，紋理分析技術(shù)目前仍存在著一些問題，例如影像采集模式及分割閾值等都會影響所提取特征的測量結(jié)果，部分紋理特征也存在著重復性差的局限性，此外，在圖像分割過程中手動分割圖像會導致觀察者間的差異。

總之，DCE-MRI定量參數(shù)可以評價糖尿病合并嚴重肢體缺血早期骨髓微血管灌注及滲透性的改變；基于MRI Ktrans值的紋理分析對評價糖尿病合并嚴重肢體缺血的骨髓微結(jié)構(gòu)改變是可行的。