余楠楠，陳琛

（陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723000）

乳酸鏈球菌素（亦稱乳鏈菌肽或Nisin）是一種由34個氨基酸殘基組成的抗菌多肽[1]。可以降解為人體內的各種氨基酸。無毒副作用，是一種世界公認的、安全無毒的天然食品防腐劑。能有效抑制有害菌的生長繁殖，延長產品保質期，有利于產品的貯存和運輸。

Nisin于1928年首次在發(fā)酵乳培養(yǎng)物中鑒定，并于1953年在英國作為抗菌劑在市場上銷售。1969年，Nisin被聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）批準為安全食品添加劑[2]。Nisin因生產基因穩(wěn)定、抑菌范圍廣、安全性高而陸續(xù)被許多國家所接受。目前，乳鏈菌肽在50多個國家獲得許可，中國于1990年開始批準使用Nisin。此外，它已經在食品工業(yè)中作為不同類型食品的天然生物防腐劑產生了重大影響。

本文對Nisin的不同來源及生產方法進行概述，重點介紹其抗菌活性及其在肉類、乳制品、果蔬保鮮防腐、罐頭的口感營養(yǎng)保持和酒精的渾濁變酸抑制中的研究現(xiàn)狀，并對其應用前景進行展望，為Nisin的進一步研究和綜合開發(fā)利用提供一定的參考價值。

1 種類和來源

根據(jù)乳酸菌細菌素的結構組成、分子大小、熱穩(wěn)定性、作用方式、輸出機制和抑菌能力等，乳酸菌細菌素可被分為三大類。

第一類：羊毛硫抗生素，小的（分子質量＜5 kDa）熱穩(wěn)定肽，高度翻譯后修飾，含有特征性多環(huán)硫醚氨基酸（如羊毛硫氨酸），甲基羊毛硫氨酸和不飽和氨基酸（如脫氫丙氨酸和2-氨基異丁酸）[3]。ⅠA類線型羊毛硫細菌素，以Nisin為主要代表；ⅠB類球型羊毛硫細菌素，如細菌素Mersacidin；ⅠC類雙（多）組分羊毛硫細菌素，以細菌素Lacticin 3147為代表[4]。Nisin是目前最成熟的羊毛硫抗生素。

第二類：小的（分子質量＜10 kDa）細菌素，熱穩(wěn)定的非羊毛硫氨酸含有的肽，除了去除前導肽和形成保守的N-末端硫化物橋之外，它們不經過翻譯后修飾。具有兩親性螺旋結構，這使得它們能夠插入靶細胞的膜中，導致去極化和死亡[3]。

第三類：溶菌素，高分子量（分子質量>30 kDa）細菌素，是熱敏感的大分子抗菌蛋白，它們具有區(qū)域型結構，不同的區(qū)域有易位功能，結合受體和致死活性[5]。

2 制備技術

在Nisin的生產過程中，乳酸乳球菌和乳鏈球菌是主要的生產菌[6]，通過誘變來獲得高產菌株，并通過改變培養(yǎng)基的配方進一步提高產量。發(fā)酵過程中，除產生乳鏈菌肽的細菌本身差異外，諸如其培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件、發(fā)酵類型等因素都會影響Nisin的產量。發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值和pH值的變化等因素均會對Nisin效價產生影響[7]。

陳藝強等[8]采用D113弱酸性離子交換樹脂對Nisin濃縮液進行靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸，然后將解吸液進行鹽析、抽濾、烘干和粉碎以獲得高純度的Nisin。其制備的最佳條件為pH 6，吸附時間90 min，解吸劑1 mol/L、鹽酸體積/乙醇體積=1.25，解吸速率為1 BV/h，鹽析所用氯化鈉濃度為23%。此條件下獲得的Nisin效價可達34 000 IU/mg，收率達到67.45%，具有良好的工業(yè)應用前景。

?zel等的研究中[9]，商業(yè)的Nisin通過工業(yè)化分批發(fā)酵進行生產。在酪蛋白的酶促或酸化分離后，將全脂乳或脫脂乳滅菌，隨后的乳清用作底物來大規(guī)模生產乳酸乳球菌。發(fā)酵條件在pH 6和30℃的溫度下優(yōu)化。在最佳條件下，乳酸乳球菌細胞顯示出共同的細菌生長曲線，通常在發(fā)酵8 h～10 h后測量的乳酸鏈球菌素活性最高。發(fā)酵后，對發(fā)酵物施加發(fā)泡程序以分離和濃縮產生的乳酸鏈球菌素。將發(fā)酵物的pH值降至4.5，促進乳蛋白（如酪蛋白和血清）的沉淀。然后，流體進入循環(huán)垂直管系統(tǒng)。為了確保含有乳酸鏈球菌素的液體發(fā)泡，添加0.1%吐溫80并從底部施加通風，收集在頂部形成的泡沫。在最后階段，使用氯化鈉和丙酮分離乳酸鏈球菌素，并干燥沉淀物。商業(yè)乳酸鏈球菌素制劑（通常質量比不超過2.5%的純乳鏈菌肽含量）用變性乳蛋白和NaCl標準化為106IU/g。如果1 g純乳鏈菌肽含有4×107IU，則40 IU的生物活性對應于1 μg的純乳鏈菌肽。[國際單位（IU）對應于能夠在1 mL肉湯中抑制無乳鏈球菌的一個細胞的乳鏈菌肽的量]。因此，商業(yè)乳鏈菌肽制劑的純度為2.5%，活性為 4×107IU/g。

3 抗菌活性

許多致病性細菌是對Nisin敏感的，Nisin存在的情況下可抑制其活性。Nisin對于營養(yǎng)細胞和芽孢的敏感度在不同屬甚至相同物種的不同菌株之間存在差異。Nisin的抗菌活性主要針對革蘭氏陽性菌（G+），尤其是芽孢形成菌[6]。對于孢子形成的細菌，Nisin能夠抑制其營養(yǎng)形態(tài)和孢子的生長。除此之外，Nisin還能抑制一些非孢子形成細菌，例如葡萄球菌（Staphylococcus）、乳球菌（Lactococcus）、乳桿菌（Lactobacillus）、明串珠菌（Leuconostoc）、李斯特菌（Listeria）和微球菌（Micrococcus）等。但Nisin對革蘭氏陰性菌（G-）、酵母（yeast）、絲狀真菌（Filamentous fungi）、病毒（viruses）抑制活性弱[10]。在一定條件下[如冷凍、加熱、降低pH值和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）]處理，Nisin也可抑制一些革蘭氏陰性菌（G-），如沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、假單孢桿菌（Pseudomonas）、放線桿菌（Actinobacillus）等。

Li等[11]研究高壓二氧化碳（high pressure carbon dioxide，HPCD），溫和熱（mild heat，MH）和乳鏈菌肽（0.02%）對荔枝汁中天然微生物[包括好氧細菌（aero bic bacteria，AB），酵母和霉菌]的綜合影響進行了評估。樣品在10 MPa的壓力和32、42、52℃的溫度下處理 5、10、15、20、25、30 min。當與 HPCD 結合時，溫度在好氧細菌、酵母和霉菌的滅活中起著重要作用，特別是對于52℃的好氧細菌和溫度≤42℃的酵母和霉菌，Nisin增加了好氧細菌對HPCD和MH（HPCD+MH）聯(lián)合治療的易感性。HPCD+MH在52℃下處理15 min，好氧細菌減少了4.19個對數(shù)周期，并且通過HPCD、MH和乳鏈菌肽（HPCD+MH+乳鏈菌肽）的組合實現(xiàn)了好氧細菌的完全失活。乳鏈菌肽對酵母和霉菌的失活沒有顯著影響。試驗證明，Nisin的抗菌活性主要針對革蘭氏陽性菌，對酵母和霉菌的敏感性較差。

4 保鮮防腐

4.1 肉類

肉類在存放過程中極易受到微生物、氧、酶等影響產生一些不良變化,這將嚴重影響到肉類的食用及商品價值，并會增加食源性疾病的危害。傳統(tǒng)上使用硝酸鹽來保存肉類，它們通過發(fā)酵肉制品中的微生物硝酸鹽還原酶將硝酸鹽部分轉化為亞硝酸鹽，從而抑制梭菌的生長。另一種方法是直接在肉制品中加入亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與仲胺的反應可在某些條件下產生顯著水平的亞硝胺[10]。由于亞硝胺具有致癌性，因此其在全世界范圍內受到嚴格的控制。作為一種安全無副作用的天然防腐劑，乳酸鏈球菌素自然成為肉類保鮮防腐的首選。

Karina等[12]研究溫度（10℃～30℃）、脂肪含量（20%～50%）、氯化鈉（2.5%～5.0%）和防腐劑濃度[亞硝酸鈉（0%～0.015%）、乳酸（50 mmol/L～500 mmol/L）和乳鏈菌肽（0～100 IU/g）]對肉糜系統(tǒng)中單核細胞增生李斯特菌生長的影響。測試各參數(shù)的獨立效應和同時效應，并將結果進行數(shù)學建模；在每種情況下計算抑制指數(shù)。7.5%NaCl的添加抑制了20℃和30℃下單核細胞增生李斯特菌的生長。然而在10℃時，微生物計數(shù)約達到106CFU/g。加入50 mmol/L乳酸至pH≤5，可抑制單核細胞增生李斯特菌的生長。乳酸與亞硝酸鈉或乳鏈菌肽的組合顯示出抑制效果的增強。而且，乳鏈菌肽具有低毒性，乳酸（50 mmol/L）和乳鏈菌肽（20 IU/g）的組合在預防單核細胞增生李斯特菌的生長方面更受歡迎。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用百分率表示，組間均數(shù)比較采用χ2檢驗；計量資料用表示，采用重復測量方差分析及t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

劉楠等[13]研究了0.5%的乳酸鏈球菌素對冷藏草魚片的保鮮效果，通過測定微生物總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、揮發(fā)性氣味、pH值和K值等來評價草魚片的品質變化。結果表明，在貯藏過程中，0.5%的Nisin處理的草魚片的菌落總數(shù)、TVB-N值和K值均低于對照組；pH值先降低后升高，電子鼻檢測結果表明，Nisin可有效減緩魚肉風味劣變。因此0.5%的Nisin保鮮劑對冷藏下的草魚片有較好的保鮮效果，可以延長草魚片的貨架期3 d。乳鏈菌肽用于肉制品防腐保鮮見表1。

表1 乳鏈菌肽用于肉制品防腐保鮮Table 1 Application of nisin in preservation of meat products

表1總結了乳酸鏈球菌素在肉制品保鮮中的一些實例。Nisin的添加可以對革蘭氏陽性菌起到廣譜抑菌作用，廣泛應用于冷卻肉保鮮、香腸、西式火腿切片、魚、蝦類海鮮制品、烤肉、家禽熟食等肉制品加工中，具有一定的防腐作用，延長肉制品的保質期。一般儲存期間肉系統(tǒng)中乳鏈菌肽的穩(wěn)定性主要取決于溫度、pH值、活性蛋白酶和儲存時間。

4.2 乳制品

牛奶含有豐富的營養(yǎng)成分，易于消化吸收，是理想的天然保健品。但牛奶對微生物來說也是非常好的培養(yǎng)基。奶牛的乳房不是無菌的，即使剛從健康牛乳房擠出的牛乳中微生物很少，在擠乳過程中與外界環(huán)境和擠乳容器的接觸等多種因素均能增加牛乳中微生物的數(shù)量和種類，使牛乳中細菌總數(shù)達5×105個/mL甚至更多。因此牛奶非常容易腐敗和變質，擠出的生鮮牛乳稍微不注意便會失去價值，故牛乳擠出后必須及時進行加工處理。

Nisin通常被認為是安全的，并且是唯一一種在加工奶酪、牛奶、乳制品、熱烘焙面粉和巴氏殺菌中作為天然防腐劑得到實際應用的細菌素。以乳酸鏈球菌素做食品防腐劑加入鮮牛乳中，不但可以有效延長保質期，且不影響其風味[20]。

Zhao等[21]使用棋盤微量稀釋方法評估乳鏈菌肽和紫蘇油（perilla oil，PO）與20種食源性單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌分離株的體外相互作用。在部分抑制濃度指數(shù)分別為0.125～0.25和0.19～0.375的供試菌株中觀察到協(xié)同作用。電子顯微鏡掃描觀察乳鏈菌肽和PO對單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌細胞壁和膜完整性的影響。結果表明，乳鏈菌肽和PO存在協(xié)同作用且顯著抑制牛奶樣品中金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的生長?？傊?，乳鏈菌肽和PO的組合具有顯著的抗菌活性，可以被用于食品工業(yè)以控制病原體的生長。

一種新鮮的西班牙奶酪（queso fresco，QF）與李斯特菌污染引起的疾病爆發(fā)有關。使用抗菌藥物可以解決李斯特菌污染引起的疾病。Gadotti等[22]在QF中添加尼辛（Nisin）、辛酸（octanoic acid）作為抗李斯特菌的成分。QF批次接種約104CFU/g單核細胞增生李斯特菌的5或6菌株混合物并用抗菌藥物處理。將樣品在4℃下儲存3周，并通過在PALCAM瓊脂上鋪板測定李斯特菌計數(shù)。在冷藏期間還評估了對QF指示微生物的影響。與對照相比，所有尼辛和辛酸組合（每種≥0.4 g/kg）對單核細胞增生李斯特菌都有效并在儲存20 d后最終計數(shù)減少至少3 log CFU/g。處理后大多數(shù)菌株混合物的含量立即降低，并且在儲存期間它們的數(shù)量保持低于103CFU/g。結果表明，尼辛和辛酸的組合可以控制QF中的單核細胞增生李斯特菌，對奶酪的天然菌群幾乎沒有影響，為控制QF的后處理單核細胞增生李斯特菌的污染提供了解決方案。

Ulpathakumbura等[23]使用Nisin，溶菌酶和乳酸菌（鼠李糖乳桿菌）用作生物防腐劑，而NaNO3用作化學防腐劑。在16℃成熟儲存4周，期間測量干酪的物理化學性質，例如pH值、可滴定酸度、質地和水分，評估干酪的感官特性。在乳鏈菌肽摻入的樣品中，風味、質地、氣味和總體可接受性的平均感官評分高于其他干酪樣品（p＜0.05）。因此，Nisin可以有效地保存切達干酪，且不會影響其質量特性。乳鏈菌肽用于乳制品的防腐保鮮見表2。

表2 乳鏈菌肽用于乳制品的防腐保鮮Table 2 Nisin for preservation of dairy products

表2總結了乳酸鏈球菌素在乳制品保鮮中的一些實例。乳酸鏈球菌素還可應用在干酪、煉乳、乳粉、乳飲料等各種乳制品中，能有效的抑制革蘭氏陽性菌，且不改變其風味。

4.3 果蔬

水果和蔬菜在采摘后基本上不再吸收水和合成營養(yǎng)物質，但它們仍然進行著旺盛的新陳代謝，呼吸和消耗營養(yǎng)物質以維持生命。微生物的侵染會導致植物葉片發(fā)生腐爛，最終導致質量嚴重惡化。果蔬的儲藏保鮮即采取有效措施來抑制微生物活動，降低呼吸作用，延緩果蔬的生理衰老，減少營養(yǎng)物質的消耗，最大程度保持其新鮮狀態(tài)。

邱朝坤等[29]研究溶菌酶和乳酸菌肽對草莓的保鮮效果，使用不同濃度的溶菌酶與Nisin復配液對草莓進行處理，在4℃條件下貯藏，測定草莓的爛果率、失重率、維生素C含量、還原糖含量和總酸含量。結果表明，0.01%溶菌酶與0.10%Nisin復配對草莓保鮮效果最好，貯藏前5 d無爛果。貯藏第5天草莓失重率為8.24%；維生素C含量為109 mg/100 g，下降13.6%；還原糖含量為7.21 g/100 g，上升14.3%；總酸含量為6.21 g/kg，下降 43.1%。

王大平等[30]以獼猴桃果實為試材，采用0.0（CK）、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 的 Nisin 溶液浸泡果實 1 min，在3℃～4℃下貯藏，研究Nisin對獼猴桃果實品質的影響。結果表明，與對照組相比，貯藏12 d后，0.3 g/L的Nisin溶液處理最佳，沒有腐爛現(xiàn)象，果實的失重率顯著降低，有效抑制了果實在貯藏后期可溶性固形物、可滴定酸和VC量的下降，保持良好的果實硬度，延緩了果實的衰老。

Liao等[31]采用乳鏈菌肽和溫和熱處理（Nisin+MH）作為對照，評價了熱超聲波處理（thermosonication，TS）和0.01%乳鏈菌肽輔助TS（TS+Nisin）對天然微生物滅活，營養(yǎng)品質保持和新鮮蘋果汁保質期延長的影響。通過 Nisin+MH、TS 和 TS+Nisin 在 37、42、47、52 ℃處理新鮮蘋果汁5 min～40 min。處理后，每隔5 d在8℃儲存期間評估微生物生長。溫度對TS和TS+Nisin滅活好氧菌、酵母菌和霉菌起著至關重要的作用，高達52℃的溫度可導致蘋果汁中微生物細胞的大量滅活。當蘋果汁在52℃下經TS和TS+Nisin處理30 min后，新鮮蘋果汁的原味保留率[包括89%的抗壞血酸、不可見的顏色變化、褐變度（browning degree，BD）、pH值、可滴定酸度（titratable acidity，TA）和總可溶性固形物（total soluble solid，TSS]值無明顯變化，8℃下保質期延長至15 d。乳酸鏈球菌素對蘋果汁中好氧菌有額外的滅活作用，但對酵母和霉菌的滅活作用不明顯。這些結果表明，TS和TS+Nisin（0.01%）可能用于生產新鮮的優(yōu)質蘋果汁和和延長其保質期。乳鏈菌肽用于果蔬的防腐保鮮見表3。

表3 乳鏈菌肽用于果蔬的防腐保鮮Table 3 Nisin for preservation of fruits and vegetables

表3總結了乳酸鏈球菌素在果蔬的防腐保鮮中的一些實例。有關乳酸鏈球菌素用于保存蔬菜產品的文獻的主要部分使用乳鏈菌肽與其他化學試劑或物理處理相關聯(lián)。Nisin的添加增強了其抑菌效果。

4.4 罐頭

Nisin在酸性條件下易溶、穩(wěn)定好且抑菌性強，因此適用于酸性罐頭食品的防腐[1]。使用乳酸鏈球菌素可以有效阻止抗熱微生物的生長繁殖，降低滅菌溫度，縮短滅菌時間，同時保證酸性罐頭食品的營養(yǎng)、風味和外觀。

王莉嫦[36]將乳酸鏈球菌素添加到雞汁鮑魚罐頭中，采用正交試驗法求得乳酸鏈球菌素的添加量與殺菌溫度，殺菌時間的最佳組合。當乳酸鏈球菌素濃度為300 mg/kg，殺菌溫度為118℃，殺菌時間為15 min時，鮑魚產品的感官評分最高，內容物（鮑魚）失水率為23%。達到改善鮑魚罐頭口感、降低生產成本的目的。

4.5 酒精

啤酒經常會受到啤酒片球菌或乳酸桿菌的影響，長時間儲存會產生混濁、發(fā)黏和變酸等現(xiàn)象[37]，這是在啤酒生產中需要重點控制的問題。Nisin能夠消除高達90%的革蘭氏陽性啤酒腐敗菌[38]，但是對霉菌、酵母菌等抑制效果不明顯，因此可以將這一特性應用到酒精飲料如啤酒中在啤酒生產中添加Nisin，可在不影響酵母發(fā)酵的前提下，對一些腐敗菌起到有效的抑制作用。延長貨架期，降低巴氏消毒強度，增強啤酒的品質和風味。

Sun等[39]將覆盆子提取物加入到啤酒的原料發(fā)酵材料中，得到覆盆子健康生啤酒，為了延長保質期，在覆盆子健康生啤酒中加入不同濃度的乳酸鏈球菌素，結果表明乳酸鏈球菌素對保質期有明顯影響，加入0.02 mg/mL乳鏈菌肽后，覆盆子健康生啤酒保質期為44 d，保質期延長36 d。

5 展望

在食品行業(yè)，我國目前為止可使用的防腐劑品種較少，而化學防腐劑因會對人體造成一定的毒害作用，具有一定的局限性。Nisin作為一種天然、低毒、高效的生物防腐劑，在食品工業(yè)中具有廣闊的應用前景。但是，由于目前對Nisin的研究還處于初級階段，生產規(guī)模小，發(fā)酵水平低，成本較高的限制，Nisin的市場售價遠遠高于化學防腐劑，這使得其廣泛的應用受到嚴重制約。認識到對Nisin研究的不足以后，應加大對Nisin的基礎研究和應用，利用生物技術研發(fā)出優(yōu)良的工程，進一步研究Nisin的性質及作用機理。以期實現(xiàn)生產成本低，規(guī)模化生產等諸多目標，隨著微生物發(fā)酵Nisin技術的進步和工業(yè)化生產的發(fā)展，這些問題都將得到解決，天然生物防腐劑在食品安全行業(yè)中也會得到更加廣泛的應用。