趙 宇，劉 洋

(四川大學華西醫(yī)院特需醫(yī)療中心，四川 成都 614000)

癲癇是臨床常見的慢性、進行性、反復性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患病率僅次于腦血管疾病，患者大腦神經(jīng)細胞過度異常放電可導致短暫性大腦功能障礙，造成海馬神經(jīng)元損傷，損害其認知功能，并引發(fā)患者焦慮、抑郁等心理障礙，嚴重威脅其身心健康，給社會和家庭帶來沉重負擔[1-2]。目前，臨床主要應用丙戊酸鈉、卡馬西平及左乙拉西坦等抗癲癇藥治療該病，但存在療效較差、易形成耐受性和毒副作用大等缺點，而中藥可彌補這些缺陷，在癲癇治療中發(fā)揮著重要作用。復方丹參滴丸可活血化瘀、理氣止痛，能減輕炎癥反應，控制癲癇發(fā)作，改善學習記憶功能、修復海馬神經(jīng)元損傷，在臨床上被廣泛用于治療癲癇，但其藥理機制目前尚不清楚[3-4]。癲癇的病理機制復雜，其中小膠質細胞及星形膠質細胞活化促使炎癥因子產(chǎn)生，導致神經(jīng)炎癥是其主要發(fā)病機制[5]。JAK/STAT3信號可介導神經(jīng)炎癥過程，抑制其激活，可減少促炎因子產(chǎn)生，減輕神經(jīng)炎癥，預防癲癇的發(fā)生，緩解其病情發(fā)展[6-7]。另外，丹參酮 ⅡA可通過抑制JAK/STAT信號逆轉心肌肥厚，且根據(jù)基因表達譜和分子指紋技術分析可知，調控JAK/STAT信號是復方丹參滴丸治療頸動脈粥樣硬化的作用機制[8-9]。因而，可推測復方丹參滴丸可能通過調控JAK-STAT 通路對癲癇模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用，本研究通過建立癲癇模型大鼠，對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體重200～240 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，大鼠質量合格證號為 2015000504404，許可證號為SC-XK(滬)20082-005。所有大鼠在四川大學華西醫(yī)院動物房中飼養(yǎng)，12 h/12 h交替光照，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持環(huán)境整潔、安靜，通風良好，大鼠自由飲食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

1.2.1 藥品與試劑：復方丹參滴丸(天士力制藥集團股份有限公司，批準文號：國藥準字Z10950111)；托伐替尼(貨號為HY-40354，美國MCE公司)；戊四氮(貨號為P6500，上海赫果生物科技有限公司)；氯化鋰(貨號為S24112，上海源葉生物科技有限公司)；大鼠TNF-α 及IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗、羊抗兔二抗(貨號分別為ab100785、ab100772、ab39636、ab32101、ab68153、ab76315、ab181602、ab150077，美國Abcam公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒及HE染色試劑盒(貨號分別為P0 013 K、P0011、C0105，上海碧云天公司)等。

1.2.2 儀器：Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XC105)；輪轉切片機、包埋機和烤片機(德國Leica 公司，型號：RM2035、EG1160和HI1220)；光學顯微鏡(日本尼康公司，型號：SMZ745)；酶標儀(德國Perkin Elmer公司，型號：XElx800)；低溫高速離心機(德國 Eppendorf 股份公司，型號：Centrifuge 5424R)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(美國Bio-Rad公司，型號：1659001、Trans-Blot SD)；凝膠成像儀(Miulab公司，型號：GIS-500)等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥：參照文獻制備動物模型[10]。SD大鼠以127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰；24 h后以35 mg/kg劑量腹腔注射戊四氮；30 min后，觀察大鼠面肌抽動、前肢陣攣、后肢陣攣及跌倒等癥狀。根據(jù)Racine分級評價癲癇發(fā)作級別，Ⅰ級為面部出現(xiàn)陣攣；Ⅱ級為頸部肌肉痙攣，出現(xiàn)甩尾或節(jié)律性點頭；Ⅲ級為出現(xiàn)單側前肢抽搐；Ⅳ級為出現(xiàn)雙前肢抽搐；Ⅴ級為出現(xiàn)四肢抽搐、失去平衡、跳躍及跌倒等[11]。如建模大鼠持續(xù)出現(xiàn)Ⅳ級以上癲癇發(fā)作表現(xiàn)，說明建模成功。建模52只，最終成功48只，隨機分為模型組、復方丹參滴丸組、托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組，每組12只；另取12只SD大鼠腹腔注射等劑量無菌0.9%氯化鈉溶液，設為對照組。將復方丹參滴丸[12]、托伐替尼[13]溶于0.9%氯化鈉溶液分別配制為8、0.62 mg/ml溶液，復方丹參滴丸與托伐替尼均以10 ml/kg劑量灌胃，模型組與對照組以等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組均1日1次，持續(xù)28 d。

1.3.2 大鼠癲癇發(fā)作情況檢測：結束用藥24 h后，觀察各組大鼠癲癇發(fā)作情況，記錄其1 d內(nèi)發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間。

1.3.3 大鼠認知功能檢測：大鼠癲癇發(fā)作情況檢測結束后，參照文獻進行Morris水迷宮實驗[14]，測定平均逃避潛伏期及大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺原位置的次數(shù)，以此評定大鼠認知功能。

1.3.4 大鼠海馬神經(jīng)元病理變化檢測及標本采集：大鼠認知功能檢測結束后，經(jīng)尾靜脈取血2 ml，靜置后離心收集上清液，血清儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩⒋笫筇幩?，解剖取出大腦，以PBS沖洗干凈后，剪取約0.5 g腦組織，加入蛋白裂解液后制備為勻漿液，離心收集上清液，提取得到總蛋白樣品液；剩余組織置于4%多聚甲醛中固定，以梯度酒精(由低到高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最后以切片機做病理切片；選取含有海馬組織的病理切片脫蠟后，使用由高濃度到低濃度酒精浸泡處理；參照說明書的步驟以HE試劑盒進行染色，再次脫水、透明后封片，采用顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元病理變化，任選5個視野拍照。

1.3.5 大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)水平測定：取“1.3.4”項下凍存的血清置于4 ℃解凍，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定其中TNF-α、IL-6含量，具體操作按照說明書進行。

1.3.6 免疫印跡法：“1.3.4”項下凍存的蛋白樣品液置于4 ℃凍融，參照說明書的步驟以BCA試劑盒測定其濃度；各組取含相同質量總蛋白樣品液電泳分離蛋白，并將其轉移至硝酸纖維膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，截取目的蛋白條帶置于小盒中，以兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗后，加入羊抗兔二抗，室溫置于搖床上孵育2 h，以TBST再次漂洗，以增強化學發(fā)光法顯色，采用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶，以Image Lab軟件對其進行分析，得出蛋白相對表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 五組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間比較

與對照組相比，模型組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯增多，持續(xù)時間明顯延長；與模型組相比，復方丹參滴丸組、托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯減少，持續(xù)時間明顯縮短；與復方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯減少，持續(xù)時間明顯縮短，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 五組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間比較Tab 1 Comparison of the frequency and duration of seizure

2.2 五組大鼠海馬神經(jīng)元病理變化

對照組大鼠海馬神經(jīng)元呈帶狀分布，細胞形態(tài)正常，結構清晰，胞漿透明，胞核規(guī)則呈圓形或橢圓形，核膜、核仁明顯，染色質分布均勻，無病理變化；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂、疏松且失去正常結構，胞體變?yōu)槿切位虿灰?guī)則圖形，胞質濃縮、深染，胞核固縮，核膜、核仁不明顯，胞漿呈空泡樣改變，細胞凋亡，數(shù)量顯著減少等病理損傷；與模型組相比，復方丹參滴丸組、托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕；與復方丹參滴丸組、托伐替尼組相比，復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷進一步減輕，見圖1。

A.對照組；B.模型組；C.復方丹參滴丸組；D.托伐替尼組；E.復方丹參滴丸+托伐替尼組A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group圖1 HE染色檢測五組大鼠海馬神經(jīng)元病理變化(×400)Fig 1 Pathological changes of hippocampal neurons in five groups of rats by HE staining (×400)

2.3 五組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺原位置次數(shù)比較

與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺原位置次數(shù)明顯減少；與模型組相比，復方丹參滴丸組大鼠穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多，托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多；與復方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 五組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺原位置次數(shù)比較Tab 2 Comparison of escape latency and times of traversing the original platform position among five groups

2.4 五組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

與對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高；與模型組相比，復方丹參滴丸組、托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低；與復方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 五組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Tab 3 Comparison of serum TNFα-, IL-6 levels among

2.5 各組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關蛋白表達比較

與對照組相比，模型組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達明顯升高；與模型組相比，復方丹參滴丸組、托伐替尼組及復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達明顯降低；與復方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。

A.對照組；B.模型組；C.復方丹參滴丸組；D.托伐替尼組；E.復方丹參滴丸+托伐替尼組A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group圖2 免疫印跡檢測五組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關蛋白表達Fig 2 Expression of proteins associated with the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups by Western Blot

表4 五組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關蛋白的相對表達比較Tab 4 Comparison of relative expression of proteins related to the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups

3 討論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可長期反復發(fā)作，難以治愈，大多數(shù)患者需長期服藥，甚至終身不能停藥，嚴重影響患者的生活質量，甚至因焦慮、抑郁增加其患精神疾病的風險。近年來，癲癇發(fā)病人數(shù)逐年增加，因而關于癲癇研究具有重大的臨床及社會意義[15]。神經(jīng)膠質細胞激活，促使TNF-α、IL-6等促炎因子合成并釋放，引發(fā)神經(jīng)炎癥，造成海馬神經(jīng)元損傷是癲癇的主要病理機制[16]。本研究以腹腔注射氯化鋰及戊四氮方法建立癲癇模型，結果顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)排列紊亂、疏松且失去正常結構，胞體變?yōu)槿切位虿灰?guī)則圖形，胞質濃縮、深染，胞核固縮，核膜、核仁不明顯，胞漿呈空泡樣改變，細胞凋亡，數(shù)量顯著減少等病理損傷癥狀；且大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯增多，持續(xù)時間、逃避潛伏期明顯延長，血清TNF-α及IL-6水平明顯升高，穿越平臺原位置次數(shù)明顯減少。表明經(jīng)氯化鋰及戊四氮處理后，大鼠出現(xiàn)炎癥反應，海馬神經(jīng)元及認知功能受損，出現(xiàn)癲癇典型臨床癥狀，揭示模型建立成功。

中醫(yī)認為，癲癇屬“癇證”，病因病機復雜，風痰上擾，血瘀風阻，氣機逆亂，引起清竅蒙蔽是其主要病機，治療應以祛除痰阻、清痰化濁、活血化瘀及安心寧神為主。復方丹參滴丸由丹參、三七和冰片組成，具有止痛散結、活血通經(jīng)和補心安神之功效，還可有效消除氧自由基，降低炎癥因子水平，減輕腦部炎癥，并減少神經(jīng)興奮遞質釋放，阻滯神經(jīng)元異常放電，起到抗癲癇作用[4,17]。研究結果發(fā)現(xiàn)，激活JAK/STAT通路，可引發(fā)神經(jīng)炎癥，導致癲癇的發(fā)生，阻滯該通路激活對癲癇的治療具有關鍵作用[18-19]。復方丹參滴丸的主要成分丹參可抑制JAK/STAT活化，減輕炎癥反應，緩解肺纖維化進程[20]。因此，可推測復方丹參滴丸治療癲癇的作用機制可能是通過下調JAK-STAT 通路實現(xiàn)。本研究結果顯示，癲癇模型大鼠腦組織p-JAK/JAK及p-STAT3/STAT3表達明顯升高；經(jīng)復方丹參滴丸及托伐替尼處理后，JAK-STAT 通路蛋白磷酸化水平降低，且大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕，其癲癇發(fā)作次數(shù)減少，持續(xù)時間、逃避潛伏期縮短，血清TNF-α及IL-6水平降低，穿越平臺原位置次數(shù)增多。表明癲癇大鼠JAK-STAT 通路處于激活狀態(tài)，復方丹參滴丸可抑制JAK-STAT 通路磷酸化激活，與JAK抑制劑托伐替尼作用相似，均可降低促炎因子合成、分泌，抑制炎癥反應，阻止癲癇發(fā)作，減輕海馬神經(jīng)元損傷，修復大鼠認知功能。復方丹參滴丸與托伐替尼聯(lián)合處理模型大鼠，可進一步減輕大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷，減少癲癇發(fā)作次數(shù)，縮短持續(xù)時間，降低血清TNF-α、IL-6水平和腦組織JAK、STAT3蛋白磷酸化水平，使大鼠穿越平臺原位置次數(shù)增多。表明復方丹參滴丸與托伐替尼聯(lián)合應用可協(xié)同下調JAK-STAT 信號磷酸化，抑制炎癥發(fā)生，減輕海馬神經(jīng)元損傷及癲癇發(fā)作，修復受損認知功能，揭示抑制JAK/STAT3信號激活可能是復方丹參滴丸改善癲癇大鼠臨床癥狀的藥理機制之一。

綜上所述，復方丹參滴丸可降低炎癥因子合成、釋放，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，減少癲癇發(fā)作次數(shù)并縮短發(fā)作時間，促使認知功能恢復，改善癲癇大鼠臨床癥狀，抑制JAK/STAT3信號激活可能是其作用機制之一。但本研究未使用JAK/STAT3通路激動劑進行對照驗證，關于復方丹參滴丸治療癲癇的藥理機制的證據(jù)并不充分，還需要后續(xù)深入研究。