張立娜 張曉東 王怡天 董梅英 魯雪林 王秀萍

摘要：以大葉蒲公英耐鹽愈傷組織為試驗(yàn)材料，采用植物組織培養(yǎng)的方法，研究不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、培養(yǎng)光質(zhì)、移栽基質(zhì)配比對其耐鹽性愈傷組織分化和組培苗生長的影響。結(jié)果表明，在相同不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨鹽脅迫濃度梯度升高，大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織分化率呈現(xiàn)降低的趨勢;在大葉蒲公英耐鹽性組培苗培養(yǎng)過程中，選擇紅 ∶白=2 ∶3 的光質(zhì)，有利于組培苗的生長;幼苗移栽到 蛭石 ∶營養(yǎng)土 ∶珍珠巖=1 ∶4 ∶3的混合基質(zhì)上成活率最高，為78%。最優(yōu)培養(yǎng)條件的確定對大葉蒲公英組培苗的后期高成苗率提供了保障。

關(guān)鍵詞：大葉蒲公英;組織培養(yǎng);基質(zhì)配比;耐鹽性;株系;成活率

中圖分類號：S567.23+9.043?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0174-04

我國從濱海到內(nèi)陸，從低海拔地區(qū)到高原地區(qū)都分布著不同類型的鹽漬化土壤，而且由于氣候變化、農(nóng)業(yè)灌溉方法不當(dāng)、過度放牧等原因，土壤次生鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[1]。在耕地面積有限的情況下，開發(fā)利用鹽荒地、選擇培育耐鹽植物品種及尋找提高植物耐鹽性的途徑和方法是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。

蒲公英為菊科多年生的草本植物，耐性好，適應(yīng)性強(qiáng)，為常用的清熱、解毒、消炎藥，同時也是一種保健野菜，被國家衛(wèi)生部列為藥食兼用食品[3]。隨著人們對蒲公英功能特性研究的深入和對健康生活追求的不斷提升，市場對優(yōu)良蒲公英品種的需求日益增長，開發(fā)利用蒲公英的耐鹽特性，培育優(yōu)良的耐鹽品種對于蒲公英的開發(fā)利用以及鹽漬化土壤的利用和改良都具有重要的意義[4]。大葉蒲公英的營養(yǎng)價值、醫(yī)療價值和經(jīng)濟(jì)價值都較高，而且生物量大，開發(fā)利用前景廣闊。通過組織培養(yǎng)篩選耐鹽的愈傷組織，進(jìn)而培育出耐鹽的品種或品系，是蒲公英生物技術(shù)抗性育種的研究方向之一[5]。陳華等利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立了藥蒲公英的植株再生體系[6];張新果等通過篩選藥蒲公英的愈傷組織獲得藥蒲公英的耐鹽愈傷組織，并進(jìn)一步研究其生理生化特性[7-8];劉艷芬等以大葉蒲公英為材料，建立了完整的蒲公英再生體系，并篩選到不同梯度的耐鹽愈傷組織，誘導(dǎo)獲得大葉蒲公英耐鹽變異株[9-10]。

筆者所在課題組前期以大葉蒲公英葉片為外植體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，在含鹽培養(yǎng)基上篩選獲得了不同鹽濃度梯度下的耐鹽愈傷組織[9-10]，并通過進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得了不同鹽濃度梯度下的耐鹽性變異株系。本研究以不同鹽濃度梯度下的大葉蒲公英耐鹽性變異株系為試驗(yàn)材料，研究不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、培養(yǎng)光質(zhì)、移栽基質(zhì)配比對其生長的影響，以期為進(jìn)一步快速、高效地培育大葉蒲公英耐鹽品種及促進(jìn)蒲公英產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以大葉蒲公英葉片為外植體，經(jīng)不同鹽濃度梯度（0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%）培養(yǎng)基篩選得到耐鹽性愈傷組織，分別命名為T1、T2、T3、T4、T5、T6[9]，通過進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得了蒲公英耐鹽再生株系。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度為1 500～2 000 lx，光照時間為16 h/d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將耐鹽性愈傷組織在MS+0.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.01 mg/L萘乙酸（NAA）的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（前期試驗(yàn)），連續(xù)觀察25 d，并記錄組培苗不定芽生長分化情況。

1.2.2 培養(yǎng)光質(zhì)對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長勢的影響

以“1.2.1”節(jié)中的試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇大葉蒲公英耐鹽性變異體T2作為后續(xù)試驗(yàn)材料。繼代培養(yǎng)后，將生長健壯的T2組培苗分為2組（Y1-T2、Y2-T2），每組10瓶，在紅白光（2 ∶3）和日光燈的光照條件下培養(yǎng)。25 d后測定并記錄組培苗葉長、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量。

1.2.3 基質(zhì)配比對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

選取直徑為50 mm的育苗盆，每盆裝60 g不同配比基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。第1組試驗(yàn)共6個基質(zhì)配比處理（A～F），每個處理5個重復(fù);在第1組試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，改良營養(yǎng)土和蛭石比例，并添加不同比例珍珠巖，進(jìn)行第2組6個基質(zhì)配比處理（G～L），每個處理5個重復(fù)（表1）。幼苗生長溫度控制在（25±2） ℃，相對濕度控制在（70±2）%，分別在移栽后5、10、15、20、25、30 d記錄幼苗成活率，根據(jù)成活率及生長狀況選取最適宜生長基質(zhì)配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

將大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后，蒲公英耐鹽性愈傷組織 T1～T6 均出現(xiàn)分化增殖現(xiàn)象，幼苗基部逐漸腫大，并有新的愈傷生成，新葉逐漸生長，顏色為淺綠色。20 d后，蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T6組培苗均發(fā)生不同程度的不定芽分化，25 d后剔除褐變及染菌材料，統(tǒng)計誘導(dǎo)發(fā)生情況。觀察發(fā)現(xiàn)，同種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對不同大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織的不定芽分化影響不同（表2），隨著鹽脅迫濃度增高，愈傷組織不定芽分化程度降低。蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T3不定芽分化較多，幼苗生長較好;蒲公英耐鹽性愈傷組織T4～T6不定芽分化減少，葉片發(fā)黃，幼苗長勢弱（圖1）。蒲公英耐鹽性愈傷組織T2的不定芽增殖倍數(shù)較高，為8.3，分化率高，且幼苗生長狀態(tài)良好，所以后期幼苗移栽等試驗(yàn)選取愈傷組織T2分化形成的蒲公英耐鹽性變異株系。

2.2 培養(yǎng)光質(zhì)對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長勢的影響

從圖2可以看出，不同光譜條件對蒲公英組培苗生長勢有著明顯的影響，2 ∶3紅白光照射下的Y2-T2比日光燈照射下的Y1-T2長勢好，生長速度快。Y2-T2的葉片平均長度為6.5 cm，而Y1-T2的葉片平均長度僅為4.3 cm（圖2-B）。Y2-T2的平均干質(zhì)量為0.81 g，鮮質(zhì)量為1.77 g，Y1-T2的平均干質(zhì)量為0.39 g，鮮質(zhì)量為1.23 g（圖2-A）。在2 ∶3紅白光照射下，幼苗的葉片長度，干質(zhì)量、鮮質(zhì)量都大于日光燈下。因此，在蒲公英組培苗培養(yǎng)過程中時， 可選擇紅 ∶白=2 ∶3的光質(zhì)， 以提高蒲公英組培苗的生長速度及幼苗長勢。

2.3 基質(zhì)配比對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

由第1組試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，幼苗移栽到基質(zhì)中30 d 后，蛭石和營養(yǎng)土的比例為2 ∶3時幼苗成活率最高，為60%。但是葉色黃綠，長勢一般，根系生長弱。為了進(jìn)一步提高移栽幼苗成活率，第2組試驗(yàn)適當(dāng)調(diào)節(jié)蛭石和營養(yǎng)土比例，并加入了一定量的珍珠巖。當(dāng)蛭石、營養(yǎng)土和珍珠巖比例為 1 ∶4 ∶3 時成活率最高，為78%，且幼苗葉片呈青綠色，葉基堅挺，根系長勢較好，新根長出1～4條，說明該比例較適于幼苗移栽成活。

3 討論與結(jié)論

3.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

鹽脅迫能夠改變細(xì)胞膜的正常透性，影響細(xì)胞一系列的生理代謝，造成植物發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長和分化[11]。徐爽在對蘋果屬2種植物愈傷組織和組培苗的生長發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使得2種蘋果屬植物的生長速率受到了較大的影響，并且出現(xiàn)了不同程度的組織損傷，給蘋果的健康帶來了較大損害[12]。本研究中，相同的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對不同蒲公英耐鹽性愈傷組織的不定芽分化影響不同，隨鹽脅迫濃度梯度增高，愈傷組織不定芽分化率逐漸降低。蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T3不定芽分化較多，幼苗生長較好;蒲公英耐鹽性愈傷組織T4～T6不定芽分化減少，葉片發(fā)黃，幼苗長勢弱。說明前期的鹽脅迫培養(yǎng)對愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生了滲透損傷，使得愈傷組織的分化能力降低，且隨著鹽脅迫濃度的增高，這種損傷增大，愈傷組織分化程度降低且幼苗長勢變?nèi)酢?/p>

3.2 培養(yǎng)光質(zhì)對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長勢的影響

魏星等通過研究不同光質(zhì)對菊花組培苗生長的影響認(rèn)為，新型半導(dǎo)體光源LEDs是植物組織培養(yǎng)的理想光源[13]。蘇俊等對煙草組培苗的研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，紅藍(lán)綠和紅藍(lán)白組合光質(zhì)，使煙草組培苗植株株高、葉長、葉寬、葉面積、莖粗、根數(shù)、根長和干質(zhì)量顯著增加，植株葉綠素含量也有提高但差異不顯著[14]。任桂萍等使用LED的不同光源照射蝴蝶蘭組培苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同光源對其生根和分化增殖效果的影響不同，紅色的LED光照射可以促進(jìn)葉芽的生長，而對于葉綠素的增長沒有促進(jìn)作用[15]。孫翊等對非洲菊組培苗的研究發(fā)現(xiàn)，不同LED光質(zhì)條件下，非洲菊組培苗的增殖系數(shù)差異顯著，其中紅藍(lán)光比例為4 ∶1處理顯著高于其他處理[16]。在本研究中，大葉蒲公英組培苗培養(yǎng)過程中，選擇 2 ∶3 紅白光質(zhì)，增強(qiáng)了植物的光合作用效率，使得幼苗葉片長度及干鮮質(zhì)量都有明顯增加，提高了組培苗的生長速度，為快速繁育大葉蒲公英耐鹽性變異株提供了有利條件。

3.3 基質(zhì)配比對大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

細(xì)蛭石保水性效果好，珍珠巖透氣性較好，二者混合，保證了基質(zhì)的保水透氣性，搭配適量營養(yǎng)土，能夠提供植物生長所需土壤營養(yǎng)成分，提高大葉蒲公英耐鹽性變異株移栽成活率。本研究將根系生長良好的大葉蒲公英耐鹽性變異株，移栽于營養(yǎng)土 ∶蛭石 ∶珍珠巖=1 ∶4 ∶3的混合基質(zhì)中時，移栽成活率最高，達(dá)78%。

經(jīng)過對大葉蒲公英耐鹽愈傷組織的不定芽分化誘導(dǎo)、培養(yǎng)光質(zhì)的選擇和移栽基質(zhì)的篩選，使其組培苗移栽技術(shù)得以完善，基本建立了大葉蒲公英耐鹽性變異株系的培育體系，為后續(xù)培育和開發(fā)應(yīng)用大葉蒲公英耐鹽株系提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李建國，濮勵杰，朱 明，等. 土壤鹽漬化研究現(xiàn)狀及未來研究熱點(diǎn)[J]. 地理學(xué)報，2012，67（9）：1233-1245.

[2]劉云芬，彭 華，王薇薇，等. 植物耐鹽性生理與分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（12）：30-36.

[3]石國慧，陳遠(yuǎn)才，王旭德，等. 藥食同源品蒲公英抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2017，34（9）：858-862.

[4]楊小玲，侯正仿，季 靜. 耐鹽植物育種研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（8）：213-216.

[5]陳 華，李銀心. 蒲公英研究進(jìn)展和用生物技術(shù)培育耐鹽蒲公英展望[J]. 植物學(xué)通報，2004，21（1）：19-25.

[6]陳 華，李 平，劉 晶，等. 藥蒲公英再生體系的建立和優(yōu)化[J]. 生物工程學(xué)報，2005，21（2）：244-249.

[7]張新果，陳顯揚(yáng)，姜 丹，等. 耐鹽藥蒲公英（Taraxacum officinale Weber.）愈傷組織篩選及生理生化特性分析[J]. 生物工程學(xué)報，2008，24（7）：1202-1209.

[8]張新果，李銀心，陳 華，等. 藥蒲公英（Taraxacum officinale Weber.）耐1.5% NaCl變異體的篩選及特性分析[J]. 生物工程學(xué)報，2008，24（2）：262-271.

[9]劉艷芬，王秀萍，陳翠果，等. 大葉蒲公英愈傷組織耐鹽突變體誘導(dǎo)與鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，47（2）：102-106.

[10]劉艷芬，王秀萍，陳翠果，等. 大葉蒲公英耐鹽突變體的篩選與植株再生[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（21）：106-109.

[11]趙曉惠. 鹽脅迫下旱稻鄭2愈傷組織的生理生化響應(yīng)[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)，2007.

[12]徐 爽. 鹽脅迫下蘋果屬兩種植物愈傷組織和組培苗的生長發(fā)育以及耐鹽機(jī)理研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2015（9）：15.

[13]魏 星，顧 清，戴艷嬌，等. 不同光質(zhì)對菊花組培苗生長的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（12）：344-349.

[14]蘇 俊，劉昳雯，楊 凡，等. 不同光質(zhì)對煙草組培苗生長及生理特性的影響[J]. 西北植物學(xué)報，2014，34（6）：1206-1212.

[15]任桂萍，王小菁，朱根發(fā). 不同光質(zhì)的LED對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)增殖及生根的影響[J]. 植物學(xué)報，2016，51（1）：81-88.

[16]孫 翊，殷麗青，張永春，等. 不同LED光質(zhì)對非洲菊組培苗生長及生理特性的影響[J]. 分子植物育種，2017，15（12）：5140-5147.

收稿日期：2019-08-09

基金項(xiàng)目：河北省農(nóng)林科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（編號：F18R18001）;河北省重點(diǎn)研發(fā)計劃（編號：16226304D）。

作者簡介：張立娜（1983—），女，河北任丘人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事作物種質(zhì)創(chuàng)新及基因挖掘研究。E-mail：3336905069@qq.com。

通信作者：張曉東，副研究員，主要從事濱海鹽堿地高效利用方面的研究。E-mail：bhszxd@163.com。