陳兆榕，葉麗宏，華怡靜，金欽，張淑清，許文*，徐偉*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

中藥大血藤[Sargentodoxacuneate(Oliv.) Rehd.et Wils.]別名為紅藤、千年健、血木通等，具有清熱解毒，活血，祛風(fēng)止痛，主治腸癰腹痛，痢疾，閉經(jīng)，痛經(jīng)，乳痛，風(fēng)濕痹痛等疾病[1]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，大血藤的化學(xué)成分分為有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)等[1-3]?！吨袊?guó)藥典》2015年版大血藤尚未收載其含量測(cè)定項(xiàng)，鑒別采用對(duì)照藥材薄層色譜鑒別法，尚沒(méi)有具體檢測(cè)的指標(biāo)性成分[4]。

到目前為止，對(duì)大血藤質(zhì)量控制已有文獻(xiàn)報(bào)道：韋漢燕等[5]采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定大血藤三氯甲烷部位的指紋圖譜；葛明菊等[6]采用HPLC法對(duì)大血藤葉片的黃酮類(lèi)進(jìn)行分析；荊彥民等[7]采用HPLC同時(shí)測(cè)定大血藤中綠原酸、咖啡酸和香草酸的含量，丁越等[8]采用HPLC對(duì)大血藤藥材中綠原酸成分進(jìn)行含量測(cè)定；劉曉涵等[9]采用超高效液相色譜(UPLC)法同時(shí)測(cè)定大血藤4種化學(xué)成分(沒(méi)食子酸、原兒茶酸、紅景天苷、綠原酸)的含量；Li等[10]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定3，4-二羥基苯乙醇苷、紅景天苷、綠原酸和鵝掌楸堿成分含量，李宛蓉等[11]建立不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜研究，并對(duì)紅景天苷和綠原酸的含量進(jìn)行測(cè)定，李浩等[12]對(duì)大血藤藥材和飲片中綠原酸、3,4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷和紅景天苷及總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。這些文獻(xiàn)研究為大血藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供重要依據(jù)，但是目前方法僅測(cè)定有機(jī)酸類(lèi)或者苯乙醇苷類(lèi)的1種或幾種，未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定有機(jī)酸、黃酮、苯乙醇苷類(lèi)6種成分的定量分析方法，因此，課題組根據(jù)前期課研究，選擇大血藤中主要成分包括有機(jī)酸類(lèi)：原兒茶酸和綠原酸，苯乙醇糖苷和苷類(lèi)：紅景天苷、丁香酸葡萄糖苷，黃酮類(lèi)：原花青素B2、表兒茶素共計(jì)6種成分進(jìn)行UPLC的定量分析評(píng)價(jià)研究，為其多組分質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1290型超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；CPA225D 型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E 臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。紅景天苷(批號(hào)：MUST-20121227)和原花青素B2(批號(hào)：MUST-17042920)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；丁香酸葡萄糖苷(批號(hào)：BPB33228-65-8)購(gòu)自云南西力生物科技有限公司；原兒茶酸(批號(hào)：110809-200604)、表兒茶素(批號(hào)：110878-200102)和綠原酸(批號(hào)：110753-201716)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。22批次市售大血藤樣品(見(jiàn)表1)經(jīng)過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.]的干燥藤莖，樣本保存于藥用植物學(xué)標(biāo)本室。甲醇、乙腈、水均為色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)。

表1 22批大血藤樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相選用乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，流動(dòng)相比例：0～2 min，2%A→2%A，2～12 min，2%A→5%A，12～20 min，5%A→6%A，20～30 min，6%A→10%A，30～35 min，10%A→12%A，流速:0.2 mL·min-1，柱溫：40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260、275和330 nm，進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下6個(gè)對(duì)照品與其他色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000，色譜峰對(duì)稱(chēng)性良好，UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取各個(gè)對(duì)照品：原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素適量，用色譜甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.53、0.83、1.02、2.50、1.14、0.66 g·L-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入15%甲醇至刻度，即得原兒茶酸26.50 mg·L-1、丁香酸葡萄糖苷83.00 mg·L-1、紅景天苷102.0 mg·L-1、綠原酸500.0 mg·L-1、原花青素B2114.0 mg·L-1、表兒茶素66.0 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 把大血藤粉碎，過(guò)40目篩，精密稱(chēng)取粉末約0.5 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇25 mL，密塞，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷，搖勻，再次稱(chēng)重，15%甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 線(xiàn)性范圍考察 取原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的混合對(duì)照品溶液，用15%甲醇稀釋配制為不同梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大血藤中6個(gè)分析物的線(xiàn)性范圍考察

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的峰面積的RSD分別為1.0%、1.1%、0.9%、0.3%、1.2%、1.8%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為170615的大血藤樣本，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.2%、0.7%、0.7%、0.8%、1.2%、0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批的大血藤樣本(批號(hào)：170615)0.5 g，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.050 5、0.569 0、1.500、15.88、2.279、1.705 mg·g-1，RSD分別為1.2%、2.3%、2.5%、1.8%、2.1%、2.4%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批次大血藤約0.25 g，精密稱(chēng)定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的6種對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的峰面積，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表3 大血藤6個(gè)分析物的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定 取不同批次大血藤樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定各批次樣品，計(jì)算大血藤樣品中原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大血藤中7個(gè)分析物的含量(mg·g-1)

2.9 樣品含量聚類(lèi)分析 運(yùn)用SPSS 18.0軟件處理分析：采用系統(tǒng)聚類(lèi)法，以6種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式為主成分轉(zhuǎn)換，聚類(lèi)距離為歐式距離，聚類(lèi)方法為離差平方和法，對(duì)22批大血藤樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)，當(dāng)歐式距離介于10時(shí)，22批次樣品得以良好的區(qū)分，其中以樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品9、樣品11、樣品13、樣品14、樣品17、樣品18、樣品19、樣品20、樣品21、樣品22聚類(lèi)為第Ⅰ類(lèi)，其余的樣品1、樣品7、樣品8、樣品10、樣品12、樣品15、樣品16這7個(gè)批次聚類(lèi)為第Ⅱ類(lèi)。從聚類(lèi)表型上看，大血藤藥材存有兩種含量類(lèi)型，進(jìn)一步用GraphPad Prism 7軟件對(duì)這兩類(lèi)(Ⅰ和Ⅱ)的大血藤樣品進(jìn)行含量箱型圖統(tǒng)計(jì)分析，兩種類(lèi)型6個(gè)成分含量的箱型圖分布見(jiàn)圖3。

3 討論

3.1 大血藤提取條件的優(yōu)化 針對(duì)本次測(cè)定的6種成分，分別考查了回流提取、超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的提取率無(wú)明顯差異，超聲提取法的相對(duì)省時(shí)、方便、操作誤差較小，因此采用超聲提取法。另外考察了水、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑，考查了15、30、45、60 min提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)6種待測(cè)成分提取率的影響，最后確定最佳提取方法為15%甲醇超聲提取30 min，提取1次。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 對(duì)流動(dòng)相的選擇，考查甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)、50%甲醇-50%乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)、乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，結(jié)果顯示，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)系統(tǒng)能使6種待測(cè)成分在最短時(shí)間達(dá)到基線(xiàn)分離，且峰對(duì)稱(chēng)性良好，同時(shí)也對(duì)色譜分離的流速(0.2、0.4和0.6 mL·min-1)及梯度程序進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了大血藤色譜分析流動(dòng)相條件；波長(zhǎng)選擇，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器DAD全波長(zhǎng)掃描，原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷最大吸收波長(zhǎng)在260 nm，紅景天苷、原花青素B2、表兒茶素最大吸收波長(zhǎng)在275 nm，綠原酸最大吸收波長(zhǎng)在330 nm左右，根據(jù)最大吸收響應(yīng)值，最終選擇以260、275、330 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品含量分析結(jié)果 中醫(yī)理論認(rèn)為大血藤的主要功效為清熱解毒，祛風(fēng)止痛，現(xiàn)代藥理研究表明大血藤中有機(jī)酸類(lèi)成分綠原酸和原兒茶酸成分具有抗炎、抗菌作用[13-15]，黃酮類(lèi)成分原花青素B2、表兒茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[16-18]；而對(duì)于苯乙醇苷類(lèi)成分的紅景天苷，苷類(lèi)成分丁香酸葡萄糖苷具有抗炎、抗氧化、抑制葡萄糖苷酶活性等[19-22]，6個(gè)測(cè)定的成分均具有與大血藤傳統(tǒng)功效相類(lèi)似的活性。因此選擇原兒茶酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、綠原酸、原花青素B2和表兒茶素的6個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定研究。

對(duì)于22批不同產(chǎn)地大血藤含量測(cè)定結(jié)果表明，6種成分含量從均值上來(lái)看，綠原酸的含量最高，均值為(10.47±5.18)mg·g-1；其次為原花青素B2，均值在(1.755±0.615)mg·g-1，紅景天苷，均值在(1.162±0.900)mg·g-1，表兒茶素，均值在(1.047±0.447)mg·g-1；而丁香酸葡萄糖苷與原兒茶酸的含量均值均低于1 mg·g-1，均值分別是(0.554 5±0.164)mg·g-1和(0.075 1±0.033)mg·g-1。通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)法，當(dāng)歐式距離介于10時(shí)，22批樣品通過(guò)得到良好的分類(lèi)，共聚類(lèi)成兩大類(lèi)(Ⅰ和Ⅱ類(lèi))，通過(guò)箱型圖比較兩類(lèi)藥材6個(gè)成分的含量分布情況，可以明顯看出類(lèi)別Ⅱ的綠原酸、紅景天苷、丁香酸葡萄糖苷的含量總體箱形分布高于類(lèi)別Ⅰ，尤其含量最高的綠原酸，在類(lèi)別Ⅱ型含量顯著高于類(lèi)別Ⅰ(P<0.05)。進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地大血藤，其聚類(lèi)沒(méi)有明顯地域規(guī)律性，有待進(jìn)一步的研究。

通過(guò)聚類(lèi)模式分析提示不同來(lái)源大血藤的品質(zhì)可能存在較大的差異，建立多成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系可能更有利于反饋大血藤藥材內(nèi)在品質(zhì)，綜上，本試驗(yàn)建立UPLC同時(shí)測(cè)定大血藤中原兒茶酸、綠原酸、丁香酸葡萄糖苷、紅景天苷、原花青素B2、表兒茶素的含量方法快捷，穩(wěn)定，準(zhǔn)確，可以為后期提升大血藤的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效參考。

致謝：本項(xiàng)目在福建省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省中藥資源研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。