李 紅，唐美君，郭華偉，王志博，肖 強(qiáng)，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008)

茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedrosis virus，EoNPV)是茶尺蠖的重要病原微生物，于1977年在我國(guó)安徽茶園首次發(fā)現(xiàn)[1]，隸屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，α-桿狀病毒屬(Alphabaculovirus)[2]。由于茶尺蠖核型多角體病毒能夠在茶園中長(zhǎng)期存在，并且對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)有較高的致病力[3]，近些年科研工作者在利用EoNPV防治茶園中的茶尺蠖方面做了大量的研究，開(kāi)展了以EoNPV作為主要成分的生物農(nóng)藥制劑研制，目前已登記成生物農(nóng)藥產(chǎn)品并進(jìn)行了大面積示范應(yīng)用，已成為茶園中茶尺蠖生物防治的主要措施[4-5]。

茶尺蠖(EctropisobliquaProut，1915)和灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren，1894)是一對(duì)近緣種茶樹(shù)害蟲(chóng)[6-7]，均隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)尺蠖蛾科(Geometridae)灰尺蛾亞科(Ennominae)埃尺蛾屬(Ectropis)，主要以幼蟲(chóng)取食茶樹(shù)葉片為害，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致茶樹(shù)死亡[8-9]，對(duì)茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)造成影響。二者形態(tài)特征極為相似，過(guò)去一直被統(tǒng)稱為茶尺蠖。

在田間調(diào)查茶尺蠖的防治效果過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，EoNPV對(duì)不同地理種群茶尺蠖的防治效果差異較大[10]。基于這一現(xiàn)象，姜楠等[6]采用昆蟲(chóng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，研究明確了我國(guó)茶園中存在茶尺蠖和灰茶尺蠖兩近緣種。隨著研究的不斷深入，目前茶尺蠖兩近緣種在我國(guó)茶園中的地理分布已基本明確。茶尺蠖和灰茶尺蠖具有相對(duì)獨(dú)立的分布區(qū)域，同時(shí)還存在混發(fā)區(qū)；灰茶尺蠖的分布較茶尺蠖更廣，茶尺蠖主要分布在浙江、江蘇和安徽三省，在浙江的富陽(yáng)、臨安，安徽的宣城，江蘇的溧陽(yáng)等5個(gè)地區(qū)是兩近緣種的混發(fā)區(qū)[11-12]。

現(xiàn)有的研究表明，EoNPV可以感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，但EoNPV對(duì)這兩近緣種的毒力差異尚不清楚，且前期均采用浸葉法測(cè)定EoNPV對(duì)茶尺蠖和灰茶尺蠖的半致死濃度LC50(median lethal concentration)[10，13]。本研究首次采用葉盤法測(cè)定了EoNPV對(duì)茶尺蠖兩近緣種的半致死劑量LD50(median lethal dose)和致死中時(shí)間LT50(median lethal time)，并比較了EoNPV對(duì)茶尺蠖和灰茶尺蠖的毒力差異，可為EoNPV的后續(xù)研究，特別是指導(dǎo)EoNPV田間防控茶尺蠖和灰茶尺蠖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)

茶尺蠖幼蟲(chóng)采集于浙江省杭州市余杭區(qū)茶園(119.90°E，30.39°N)，灰茶尺蠖幼蟲(chóng)采集于廣西茶園(110.36°E，25.30°N)，室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖至少3代。實(shí)驗(yàn)幼蟲(chóng)飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(24±1)℃，光周期為13 h/11 h(L/D)，濕度(75±5)%。

1.2 EoNPV病毒液

試驗(yàn)所用茶尺蠖病毒為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所實(shí)驗(yàn)室保存的病毒毒株經(jīng)增殖提純后低溫保存?zhèn)溆玫牟《驹骸?/p>

1.3 毒力測(cè)定方法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置5個(gè)EoNPV劑量處理，即2×103、2×104、2×105、2×106、2×107PIB·頭-1，采用葉盤飼毒法進(jìn)行。先將病毒原液用蒸餾水梯度稀釋成5個(gè)不同濃度：即2×105、2×106、2×107、2×108、2×109PIB·mL-1，以蒸餾水作為對(duì)照。然后將茶樹(shù)嫩葉片用圓形打孔器制成直徑為9 mm的葉盤，用移液槍分別吸取10 μL上述不同濃度的病毒液滴至葉盤上，并將帶病毒的葉盤置于底部鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，于通風(fēng)處晾干。挑選3齡初期幼蟲(chóng)，饑餓處理6 h后，將帶病毒的葉盤和幼蟲(chóng)同時(shí)轉(zhuǎn)移至24孔板中，取食8 h后，挑出食盡葉盤的幼蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中用無(wú)病毒葉片飼養(yǎng)作為試驗(yàn)用蟲(chóng)，每個(gè)濃度處理試驗(yàn)蟲(chóng)數(shù)不少于60頭。每天記錄死亡蟲(chóng)數(shù)至試驗(yàn)用蟲(chóng)全部死亡或化蛹。飼養(yǎng)溫度(24±1)℃，光周期為13 h/11 h(L/D)，濕度(75±5)%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel統(tǒng)計(jì)各處理試驗(yàn)用蟲(chóng)的累計(jì)死亡蟲(chóng)數(shù)與累計(jì)死亡率，使用SPSS進(jìn)行顯著性分析。使用DPS軟件計(jì)算各處理的半致死劑量(LD50)和致死中時(shí)間(LT50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶尺蠖兩近緣種感染EoNPV后的死亡動(dòng)態(tài)

EoNPV不同劑量(2×103、2×104、2× 105、2×106、2×107PIB·頭-1)處理茶尺蠖和灰茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)的死亡率如圖1、圖2所示。結(jié)果顯示，EoNPV的使用劑量與茶尺蠖和灰茶尺蠖的死亡率呈正相關(guān)，病毒的使用劑量越高，死亡率也越高。在相同劑量處理下，飼喂病毒相同天數(shù)之后，茶尺蠖的死亡率要高于灰茶尺蠖。在2×103PIB·頭-1的劑量處理下，茶尺蠖在飼毒后第7天開(kāi)始死亡，而灰茶尺蠖在飼毒后第10天開(kāi)始死亡，與茶尺蠖相比灰茶尺蠖在最低劑量病毒處理下開(kāi)始死亡時(shí)間遲了3 d。而在2×104、2×105、2×106、2×107PIB·頭-14個(gè)劑量處理時(shí)，相同處理劑量下，灰茶尺蠖開(kāi)始死亡時(shí)間均比茶尺蠖遲1 d。在試驗(yàn)的最高劑量2×107PIB·頭-1處理下，茶尺蠖幼蟲(chóng)在飼毒后第10天時(shí)全部死亡，而灰茶尺蠖幼蟲(chóng)在第10天的死亡率為65%，相同劑量的病毒處理后茶尺蠖幼蟲(chóng)的死亡率高于灰茶尺蠖，這說(shuō)明EoNPV對(duì)茶尺蠖的致病力高，而對(duì)灰茶尺蠖的致病力低于茶尺蠖。

2.2 EoNPV對(duì)茶尺蠖兩近緣種的LD50和LT50

EoNPV對(duì)茶尺蠖和灰茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)的半致死劑量LD50如表1所示。結(jié)果顯示，EoNPV處理茶尺蠖的LD50為1.24×105PIB·頭-1，EoNPV處理灰茶尺蠖的LD50為3.58×106PIB·頭-1，灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的28.9倍。這表明在同樣的環(huán)境條件下，灰茶尺蠖幼蟲(chóng)被茶尺蠖病毒感染后半數(shù)個(gè)體死亡所需要的劑量是茶尺蠖的28.9倍。茶尺蠖病毒處理茶尺蠖和灰茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)的致死中時(shí)間LT50如表2所示。不同劑量處理下幼蟲(chóng)的平均死亡率與標(biāo)準(zhǔn)差如表2所示， 2×105、2×106、2×107PIB·頭-13個(gè)劑量處理間茶尺蠖幼蟲(chóng)的平均死亡率沒(méi)有顯著差異，與2×103和2×104PIB·頭-1劑量處理下幼蟲(chóng)的平均死亡率存在顯著差異。茶尺蠖病毒不同劑量處理灰茶尺蠖的平均死亡率間的顯著性與茶尺蠖的一致，但茶尺蠖的LT50均小于灰茶尺蠖，在2×107PIB·頭-1劑量處理下，灰茶尺蠖的致死中時(shí)間約為茶尺蠖的2倍，在2×106PIB·頭-1劑量處理下，灰茶尺蠖的致死中時(shí)間約為茶尺蠖的1.35倍。表明茶尺蠖病毒對(duì)茶尺蠖的毒力高于對(duì)灰茶尺蠖的毒力。

圖1 EoNPV處理后茶尺蠖的死亡動(dòng)態(tài)Fig.1 Death dynamics of E. obliqua after feeding with EoNPV

圖2 EoNPV處理后灰茶尺蠖的死亡動(dòng)態(tài)Fig.2 Death dynamics of E. grisescens after feeding with EoNPV

3 結(jié)論與討論

茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)自首次在安徽茶園發(fā)現(xiàn)后，作為茶尺蠖的專一性病原微生物開(kāi)展了系統(tǒng)研究，在EoNPV對(duì)茶尺蠖的毒性、安全性、田間防效等方面均取得了較好的進(jìn)展[14-16]。目前茶尺蠖病毒殺蟲(chóng)劑已進(jìn)入大面積推廣應(yīng)用階段，在茶尺蠖生物防治中起到了重要的作用。通常昆蟲(chóng)核型多角體病毒具有較強(qiáng)的宿主專一性，一種病毒只能感染一種昆蟲(chóng)，但也有部分昆蟲(chóng)病毒是可以同時(shí)感染多種害蟲(chóng)，如MabrMNPV(甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒)可以感染多種夜蛾科昆蟲(chóng)[17]。茶尺蠖和灰茶尺蠖是近年來(lái)研究明確的茶園害蟲(chóng)兩近緣種，也是茶園最主要的食葉類害蟲(chóng)[6]。本研究進(jìn)一步明確了EoNPV可以同時(shí)感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，這一結(jié)果也拓展了EoNPV的宿主范圍。

表1 EoNPV對(duì)茶尺蠖兩近緣種的LD50值

表2 EoNPV處理茶尺蠖兩近緣種后的平均死亡率及LT50值

前期在研究EoNPV對(duì)茶尺蠖毒力時(shí)均采用浸葉法[10，13，16]，浸葉法在葉片處理和喂飼過(guò)程相對(duì)方便，但浸葉法只能獲得病毒對(duì)宿主的LC50，無(wú)法精確到每頭幼蟲(chóng)取食病毒的量。本研究首次采用葉盤法對(duì)茶尺蠖兩近緣種進(jìn)行病毒飼喂處理，可以相對(duì)精準(zhǔn)地掌握每頭幼蟲(chóng)取食的病毒數(shù)量，獲得EoNPV對(duì)茶尺蠖和灰茶尺蠖的LD50，從而探索建立了病毒對(duì)茶樹(shù)害蟲(chóng)毒力評(píng)價(jià)的一種新方法。相對(duì)而言，采用葉盤法評(píng)價(jià)病毒對(duì)宿主的毒力的要求更加嚴(yán)格，特別是要掌握好害蟲(chóng)的蟲(chóng)齡和飼養(yǎng)的環(huán)境溫度[18]。選擇相對(duì)適合的蟲(chóng)齡可以在預(yù)期時(shí)間將葉盤全部食盡，從而保證喂飼病毒的數(shù)量。飼養(yǎng)的環(huán)境則決定著在病毒繁殖周期內(nèi)是否能有效死亡，進(jìn)而較好地獲得病毒作用宿主的不同死亡率。

盡管EoNPV可以同時(shí)感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，但結(jié)果表明其對(duì)茶尺蠖與灰茶尺蠖的敏感性存在明顯差異，灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的28.9倍，可以看出EoNPV對(duì)茶尺蠖更為敏感。桿狀病毒和宿主的相互作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，既與病毒的基因表達(dá)相關(guān)，也與宿主的抵御機(jī)制關(guān)聯(lián)。Hou等[19]利用MabrMNPV感染棉鈴蟲(chóng)和甜菜夜蛾，結(jié)果表明，病毒感染不同的昆蟲(chóng)宿主后ODV和BV具有不同的特異蛋白質(zhì)成分，這可能是宿主對(duì)病毒基因表達(dá)的響應(yīng)。Katsuma等[20]發(fā)現(xiàn)，若發(fā)生基因突變的BmNPV病毒其FP25K發(fā)生了突變，此病毒感染家蠶幼蟲(chóng)后死亡蟲(chóng)尸的液化程度比感染野生型病毒而死亡的蟲(chóng)尸低，而且半致死量(LD50)比野生型病毒的高1 000倍，反映出不同病毒毒株對(duì)宿主的作用存在差異。而作為近緣種的灰茶尺蠖和茶尺蠖對(duì)同一病毒的毒力差異機(jī)制尚不清楚，后續(xù)有必要作進(jìn)一步的深入研究。