/ .上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院；.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；.艾迪創(chuàng)格（北京）科技有限公司；.德國(guó)艾迪（AID)公司

0 引言

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫技術(shù)（Enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體的細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞情況下，統(tǒng)計(jì)斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目（即斑點(diǎn)計(jì)數(shù)）。斑點(diǎn)計(jì)數(shù)是ELISPOT數(shù)據(jù)處理最重要的一步，斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀可以對(duì)ELISPOT板上各孔斑點(diǎn)圖像進(jìn)行全自動(dòng)采集、計(jì)數(shù)及分析，從而評(píng)價(jià)機(jī)體的細(xì)胞免疫或體液免疫功能，廣泛應(yīng)用于疫苗研究、藥物篩選、感染性疾病診斷與研究及腫瘤免疫研究等免疫學(xué)相關(guān)領(lǐng)域[1-4]。值得一提的是，在疫苗的臨床評(píng)價(jià)中，斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀已經(jīng)被強(qiáng)制性用于ELISPOT中[5]，能夠有效避免偏差，增加客觀性、重復(fù)性及計(jì)數(shù)速度。但是，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)通行的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀校準(zhǔn)方法。

由于細(xì)胞保存條件苛刻，穩(wěn)定性差，不便攜帶，不適合做斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本文根據(jù)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀的技術(shù)參數(shù)，結(jié)合酶聯(lián)斑點(diǎn)的培養(yǎng)生長(zhǎng)特性，研制了模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，量值準(zhǔn)確可靠，便于存放和攜帶，均勻性和穩(wěn)定性良好，為斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀的校準(zhǔn)工作提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

晶元光罩影像式坐標(biāo)測(cè)量?jī)x[七海測(cè)量技術(shù)（深圳）有限公司]，通過(guò)計(jì)量機(jī)構(gòu)的校準(zhǔn)保證儀器測(cè)量的溯源性，每次使用前，用校準(zhǔn)過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行確認(rèn)，確保儀器處在正常工作狀態(tài)。

1.2 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

1.2.1 圖案設(shè)計(jì)

根據(jù)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀的技術(shù)參數(shù)，采用AutoCAD設(shè)計(jì)模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖形，將模擬斑點(diǎn)最終成像在塑料膜片上，見(jiàn)圖1：（1）膜片尺寸及孔位與標(biāo)準(zhǔn)96孔板一致；（2）A1、A12、H1、H12孔為定位孔：設(shè)計(jì)為“SIMT”字樣；（3）模擬斑點(diǎn)孔均勻分布在標(biāo)準(zhǔn)96孔板上：E3、B6、G6、E9孔分別設(shè)計(jì)50、100、200、500個(gè)直徑為50μm的模擬斑點(diǎn)。

1.2.2 外形設(shè)計(jì)

外形參照標(biāo)準(zhǔn)96孔板，長(zhǎng)為12.7cm，寬為8.5cm，高為1.3cm，外部包括上、下金屬框架，內(nèi)部包括白色背景紙、高透光塑料膜片和玻璃片，上、下金屬框架依靠螺釘連接緊固，具體構(gòu)造如圖2所示。

圖1 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖案

圖2 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外形

1.3 檢測(cè)方法

利用光罩影像式坐標(biāo)測(cè)量?jī)x分別拍攝模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的E3、B6、G6、E9孔，并打印在紙上，采用人工識(shí)別計(jì)數(shù)的方法，適用于均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察以及定值實(shí)驗(yàn)。

1.4 均勻性檢驗(yàn)

由于本批模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物制備了200塊，根據(jù)JJF1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》規(guī)定[6]，隨機(jī)抽取模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物15塊，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，每塊計(jì)數(shù)三次。

1.5 穩(wěn)定性考察

分別對(duì)本批模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。

1.5.1 短期穩(wěn)定性考察

短期穩(wěn)定性考察采用同步穩(wěn)定性研究進(jìn)行考察，即所有穩(wěn)定性研究的測(cè)量均能在重復(fù)性條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)?zāi)M樣品運(yùn)輸可能遇到的條件，將制備的模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物放置在-80℃冰箱、23℃實(shí)驗(yàn)室、70℃烘箱中，分別放置 1d、3d、6d、9d、14d，設(shè)置每個(gè)溫度點(diǎn)和時(shí)間點(diǎn)各取3塊，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，進(jìn)行短期穩(wěn)定性考察。

1.5.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察

長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察采用經(jīng)典穩(wěn)定性研究，即同時(shí)制備的樣品在相同條件下隨著時(shí)間的推移進(jìn)行測(cè)量。采用先密后疏的原則安排在樣品制備完成后當(dāng)天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月，對(duì)制備的模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物隨機(jī)抽取3塊，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。

1.6 定值

本批模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用多家實(shí)驗(yàn)室合作定值的方法，邀請(qǐng)了晶瑞測(cè)量技術(shù)（深圳）有限公司、七海測(cè)量技術(shù)（深圳）有限公司和上海訊量測(cè)控設(shè)備有限公司等八家單位進(jìn)行聯(lián)合定值，每個(gè)單位分別隨機(jī)抽取3塊模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。為避免設(shè)計(jì)值的主導(dǎo)，應(yīng)使實(shí)驗(yàn)人員保持對(duì)設(shè)計(jì)值的未知狀態(tài)，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，進(jìn)行定值分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法

利用光罩影像式坐標(biāo)測(cè)量?jī)x拍攝模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的E3、B6、G6、E9孔內(nèi)畫面如圖3所示，孔內(nèi)的斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，均勻排布，適合用人工識(shí)別計(jì)數(shù)的方法。隨機(jī)抽取一塊模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)七次，考察方法的重復(fù)性，精密度均為0%；隨機(jī)抽取10塊模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，按照1.3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，考察方法的再現(xiàn)性，精密度為0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性和再現(xiàn)性的精密度均較高，完全可以滿足模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的需求。

圖3 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)孔內(nèi)畫面

2.2 均勻性檢驗(yàn)

采用人工識(shí)別計(jì)數(shù)法對(duì)本批模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物隨機(jī)抽取的15個(gè)單元進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)如表1所示，可以看出模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的E3、B6、G6、E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)均為設(shè)計(jì)值，證明該批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是均勻的。

2.3 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性[6,7]，保持候選物穩(wěn)定性的措施必須貫穿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的全過(guò)程。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用過(guò)程中不可避免要涉及運(yùn)輸?shù)纫蛩?，因此，?duì)本批模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物分別進(jìn)行了短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。

表1 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 短期穩(wěn)定性考察

實(shí)驗(yàn)?zāi)M了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中可能遇到的極端條件，按照1.5.1中的方法進(jìn)行短期穩(wěn)定性考察，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示，可以看出模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的E3、B6、G6、E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)均為設(shè)計(jì)值，證明模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運(yùn)輸條件下是穩(wěn)定的，滿足實(shí)際運(yùn)輸要求。

2.3.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察

采用先密后疏的原則，按照1.5.2中的方法進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，可以看出在長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月的觀察時(shí)間內(nèi)，模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的E3、B6、G6、E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)是不變的，均為設(shè)計(jì)值。因此，模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室室溫（23±1）℃避光條件下保存，可以判定在1a內(nèi)是穩(wěn)定的。目前，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)仍在繼續(xù)監(jiān)控中。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值與不確定度評(píng)估

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用八家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值方法，結(jié)果經(jīng)過(guò)柯克倫檢驗(yàn)和格布拉斯檢驗(yàn)，所有單元的數(shù)據(jù)均可保留并參與最終定值，每家實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值和總平均值見(jiàn)表4。

表2 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性考察結(jié)果

表3 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果（個(gè)）

表4 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果不確定度評(píng)估

根據(jù)模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值數(shù)據(jù)，不同實(shí)驗(yàn)室得到的定值數(shù)據(jù)是一致的，定值過(guò)程引入的不確定度分量可以忽略不計(jì)；均勻性和穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度分量和在有效期內(nèi)的變動(dòng)性引入的不確定度分量可以忽略不計(jì)。但是在使用過(guò)程中，可能由于使用磨損導(dǎo)致斑點(diǎn)個(gè)數(shù)減少；或者由于使用中塵埃進(jìn)入導(dǎo)致識(shí)別時(shí)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)增加。

以E9孔為例，塵埃的進(jìn)入可能導(dǎo)致計(jì)數(shù)時(shí)增加1個(gè)模擬斑點(diǎn)，故由此引入的不確定度為

故模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為

模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)E3、B6、G6、E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)均少于E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)，分布更加均勻可靠，研制和使用過(guò)程中都未出現(xiàn)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)變化的情況，由于沒(méi)有確定的不確定度評(píng)定模型，因此，其他孔位均采用E9孔內(nèi)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度0.4%（k=2），模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果及不確定度見(jiàn)表5。

表5 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

2.5 模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在儀器計(jì)量校準(zhǔn)中的應(yīng)用

利用研制成功的模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀的示值誤差及重復(fù)性的計(jì)量特性進(jìn)行了考察，并在AID公司、CTL公司等10余臺(tái)儀器上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明了方法的通用性。

2.5.1 示值誤差

儀器的示值誤差以斑點(diǎn)模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)值的相對(duì)誤差表示。開啟儀器，按照使用說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)試，進(jìn)入正常工作狀態(tài)，將模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放入載物倉(cāng)并固定，分別對(duì)E3、B6、G6、E9孔拍照并計(jì)數(shù)，重復(fù)測(cè)量三次，記錄測(cè)量值，并按照式（3）計(jì)算每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)的示值誤差，取其絕對(duì)值最大者作為儀器的示值誤差。

2.5.2 重復(fù)性

測(cè)量重復(fù)性以模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)六次測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。儀器按照2.4.1的工作條件，將模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放入載物倉(cāng)并固定，將模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值為200的G6孔拍照并計(jì)數(shù)六次，按照式（4）計(jì)算測(cè)量重復(fù)性。

式中：RSD——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；

Ni——單次測(cè)量值；

3 結(jié)語(yǔ)

本文中模擬斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫反應(yīng)培養(yǎng)的斑點(diǎn)，采用AutoCAD設(shè)計(jì)模擬斑點(diǎn)圖形，外形參照標(biāo)準(zhǔn)96孔板，外部包括上、下金屬框架，內(nèi)部包括白色背景紙、高透光塑料膜片和玻璃片，上、下金屬框架依靠螺釘連接緊固，成功研制了模擬斑點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好。在實(shí)驗(yàn)室室溫避光條件下保存，穩(wěn)定性在1a以內(nèi)，攜帶方便，成功應(yīng)用到斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析儀的計(jì)量校準(zhǔn)工作中，對(duì)儀器示值誤差和重復(fù)性的計(jì)量特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為儀器日常的校準(zhǔn)工作以及國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范的制定提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。