魏子凱 丁紹敏 陸敏興 林海濤

摘要： 為了了解蠶絲蛋白纖維在消化系統(tǒng)的消化分解作用后的變化情況，通過體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，探究了蠶絲蛋白纖維在經(jīng)過人工胃液和人工腸液的消化分解作用后的形貌變化，并運(yùn)用掃描電鏡、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和粒徑分布檢測(cè)方法，測(cè)定蠶絲蛋白纖維的形貌和長度變化。結(jié)果表明：蠶絲蛋白纖維在人工胃液和人工腸液的消化分解作用后，整體外觀呈纖維短棒狀，表面較為平滑，兩端不規(guī)則，粒徑在0.5～100 μm呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布。

關(guān)鍵詞： 蠶絲蛋白纖維;人工消化液;消化分解;形貌變化;粒徑分布

Abstract： In order to understand the changes of silk protein fiber after digestion and decomposition in the digestive system， the in vitro digestion simulation experiment was carried out to explore the morphology changes of silk protein fiber after digestion and decomposition through artificial gastric juice and artificial intestinal juice， and the morphology and length changes of silk protein fiber were determined by the means of scanning electron microscope， SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and particle size distribution detection. The results showed that the silk protein fibers were short rod-like with smooth surface and irregular ends after digestion and decomposition by artificial gastric juice and artificial intestinal juice， and the particle size distribution presented logarithmic normal distribution， with the particle size of 0.5～100 μm.

Key words： silk protein fiber; artificial digestive juice; digestion; morphology changes; particle size distribution

近年來，隨著國內(nèi)外研究者對(duì)蠶絲結(jié)構(gòu)及其改性研究的不斷深入，蠶絲已不僅是傳統(tǒng)的紡織材料，還作為新型多功能材料受到眾多學(xué)者的青睞，呈現(xiàn)出欣欣向榮的景象[1]。目前，蠶絲已經(jīng)成為保健食品、醫(yī)藥材料[2-3]、生物制藥[4-6]、功能材料[7]等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，將成為新一代的安全、綠色、環(huán)保材料。

蠶絲是由外部絲膠蛋白和內(nèi)部絲素蛋白兩部分組成，幾乎全部是蛋白質(zhì)，絲膠蛋白約占30%，絲素蛋白約占70%[8]。其中，絲素蛋白中非極性氨基酸占比較大，具有良好的疏水性、力學(xué)性能和生物相容性[9-10]，這也是蠶絲蛋白成為生物醫(yī)藥材料的重要原因之一。但大多數(shù)研究將蠶絲蛋白溶解為小分子多肽作為輔助材料加以利用，這樣不僅會(huì)對(duì)蠶絲自身固有的結(jié)構(gòu)造成破壞，同時(shí)，還會(huì)增加蠶絲溶解、多肽合成的工藝流程及成本。因此，本文通過體外模擬蠶絲蛋白纖維在消化系統(tǒng)中的消化過程，探究蠶絲蛋白纖維在經(jīng)過人工消化液的消化作用后的形貌變化，為其直接作為新型的藥用材料或食用載體材料做出一定的指導(dǎo)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑如表1所示。

1.2 設(shè) 備

主要實(shí)驗(yàn)儀器型號(hào)與規(guī)格如表2所示。

2 方 法

2.1 蠶絲蛋白纖維的制備

按照參考文獻(xiàn)[11]中蠶絲蛋白纖維的制備方法，將5%的NaOH溶液與尿素按1︰6的質(zhì)量之比溶解，放入適量蠶繭，在65 ℃的水浴鍋中恒溫加熱45 min，得到長度為2～3 mm的蠶絲蛋白短纖維。

2.2 消化液的配制

2.2.1 人工胃液的配制

按照2015版《中國藥典》第三部[12]中生物制品要求，取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻使其充分溶解后，調(diào)節(jié)pH值至1.3，加水稀釋定容至1 000 mL，即為人工胃液。

空白人工胃液的配制不含胃蛋白酶，其余與人工胃液配制相同。

2.2.2 人工腸液的配制

按照2015版《中國藥典》第三部[12]中生物制品要求，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8;另外稱取10 g胰蛋白酶加適量水溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL，即為人工腸液。

空白人工腸液的配制不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 人工胃液消化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)組：稱量0.3 g蠶絲蛋白短纖維放入若干玻璃試管中，添加10 mL人工胃液，封口;置于37.3 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，每5 min手晃動(dòng)一次，觀察并記錄2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的變化情況。

對(duì)照組：稱量0.3 g蠶絲短纖維放入若干玻璃試管中，添加10 mL相同pH值的無酶空白人工胃液，封口;置于37.3 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，每5 min手晃動(dòng)一次，觀察并記錄2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的變化情況。

2.3.2 人工腸液消化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)組：取人工胃液消化實(shí)驗(yàn)4 h后的溶液過濾，將蠶絲蛋白短纖維加入若干個(gè)盛有等量人工腸液的試管中，封口;置于37.3 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，每5 min手晃動(dòng)一次，每隔2.0 h取樣觀察。

對(duì)照組：取人工胃液消化實(shí)驗(yàn)4 h后的溶液過濾，將蠶絲蛋白短纖維加入盛有等量無酶空白人工腸液的試管中，封口;置于37.3 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，每5 min手晃動(dòng)一次，每隔2.0 h取樣觀察。

2.4 光學(xué)顯微鏡檢測(cè)

取適量經(jīng)溶解、干燥處理后的蠶絲蛋白短纖維放在載玻片上，制備成臨時(shí)裝片，用光學(xué)顯微鏡對(duì)溶解后的蠶絲蛋白纖維進(jìn)行觀察，觀察蠶絲蛋白纖維的溶解程度，測(cè)定溶解后蠶絲蛋白纖維的長度，并拍照記錄。

2.5 電子顯微鏡觀察

將人工胃液和人工腸液消化處理后的蠶絲蛋白干燥，去除上部凝結(jié)、粘連的蛋白塊，取適量下層沉淀的蛋白粉末進(jìn)行觀察，觀察其形貌變化。

2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.6.1 緩沖液的配制

30%Acr的配制：將29.2 g丙烯酰胺和0.8 g N，N-甲叉雙丙烯酰胺放入燒杯中，用適量的去離子水充分溶解，直至透明，然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定容至100 mL。將配制好的溶液搖勻，儲(chǔ)存在棕色瓶中，在4 ℃的冰箱中保存。

0.5 M的Tris-HCl液的配制：將6 g的三羥基氨基甲烷（Tris）溶解于60 mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，然后用容量瓶定容至100 mL，在4℃的冰箱中保存。

1.5 M的Tris-HCl液的配制：將18.15 g的三羥基氨基甲烷（Tris）溶解于80 mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至88，然后用容量瓶定容至100 mL，在4 ℃的冰箱中保存。

10%SDS的配制：將10 g SDS溶解于80 mL的水中，并在68 ℃的水浴中加熱助溶，充分溶解后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，加水定量至100 g，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

20%SDS的配制：將20 g SDS溶解于80 mL的水中，并在68 ℃的水浴中加熱助溶，充分溶解后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，加水定量至100 g，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

10%過硫酸銨的配制：將1 g過硫酸銨溶解于10 g的去離子水中，在4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

另外，2倍樣品緩沖液的配制如表3所示;電極緩沖液的配制如表4所示。

Mark蛋白樣品的配制[13]：將20 μL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解于200 μL的去離子水中，平均分裝在20個(gè)1.5 mL的離心管內(nèi)（每個(gè)離心管內(nèi)10 μL），再將等體積的2倍樣品緩沖液加入離心管中，然后將其置于沸水中加熱5 min，待冷卻后置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。使用前，取出樣品在室溫條件下融化后，在沸水中加熱3～5 min后再上樣。

固定液的配制：將無水乙醇500 mL、冰乙酸100 mL和去離子水400 mL充分混合、搖勻，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中保存。

染色液的配制：將甲醇500 mL，冰乙酸100 mL和去離子水400 mL混合、搖勻，加入0.5 g考馬斯亮藍(lán)R-50充分溶解。

脫色液的配制：甲醇50 mL，冰乙酸75 mL，去離子水875 mL充分混合、搖勻。

2.6.2 濃縮膠和分離膠的配制

4%濃縮膠的配制如表5所示;13%分離膠的配制如表6所示。

2.7 粒徑測(cè)定

絲素蛋白是一種纖維狀的蛋白，含有非極性氨基酸比例較大，因此絲素蛋白分子親水性很差。當(dāng)蠶絲蛋白短纖維被消化液酶解之后，存在不易溶于水的蠶絲蛋白纖維殘段，無法測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量。所以，可以通過檢測(cè)消化酶解后的蠶絲蛋白纖維殘段的粒徑，來反映它的消化、分解程度。本文將經(jīng)過人工胃液溶解后的溶液干燥，利用馬爾文激光粒度儀測(cè)定消化溶解后的蠶絲蛋白纖維粒徑，用去離子水作為分散液，將樣品添加到分散液中，然后測(cè)定蠶絲蛋白纖維殘段的大小。由于蠶絲蛋白纖維殘段的粒徑為非正態(tài)分布對(duì)稱，向大顆粒方向偏高，因此采用對(duì)數(shù)正態(tài)分布進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 人工胃液消化電鏡圖

圖1為蠶絲蛋白短纖維光學(xué)顯微鏡圖，圖2為蠶絲蛋白短纖維在人工胃液中消化分解的電鏡圖。從圖1可以看出，蠶絲蛋白短纖維的長度為2～3 mm，而圖2（a）中大多數(shù)蠶絲蛋白短纖維的長度在100～200 μm，也有少部分纖維長度在200～400 μm;圖2（b）中纖維的長度分布在100 μm左右，大多數(shù)為100 μm以下，說明蠶絲蛋白短纖維經(jīng)人工胃液消化作用后，沒有被完全溶解，依然為纖維狀態(tài)，長度從毫米級(jí)變?yōu)槲⒚准?jí)的短纖維。同時(shí)，圖2（a）中的蠶絲蛋白短纖維的平均長度長于圖2（b）中的纖維長度，圖2（a）中長纖維的數(shù)量也較多，說明蠶絲蛋白短纖維在人工胃液中停留時(shí)間越長，人工胃液的消化作用使蠶絲蛋白纖維的平均長度消化變短。

圖2（c）中蠶絲蛋白短纖維的長度分布不均勻，大多數(shù)纖維長度分布在200～300 μm，還有500 mm以上的長纖維存在;與圖2（b）對(duì)比來看，說明實(shí)驗(yàn)組的人工胃液對(duì)蠶絲蛋白短纖維的溶解力較強(qiáng)，胃蛋白酶對(duì)蠶絲蛋白有一定的分解作用。

3.2 人工腸液消化電鏡圖

圖3為蠶絲蛋白短纖維在人工腸液中消化分解的電鏡圖（實(shí)驗(yàn)組電鏡圖放大倍數(shù)為1 000倍），由于對(duì)照組蠶絲蛋白纖維較長，為了更好地觀察，對(duì)照組電鏡圖放大倍數(shù)為500倍。從圖3可以看出，蠶絲蛋白短纖維依然為纖維狀，其中圖3（a）纖維的長度在30～50 μm，直徑小于10 μm，圖3（b）纖維的長度分布在10～20 μm，直徑小于10 μm，蠶絲蛋白短纖維經(jīng)人工胃液和腸液的共同消化作用后，纖維長度變?yōu)槭畮孜⒚?，且作用時(shí)間越長，纖維長度越短，說明了蠶絲蛋白短纖維能以纖維形態(tài)在人工腸液中存在4.0 h以上;兩者相比，說明蠶絲蛋白短纖維在人工腸液中隨著停留時(shí)間增加，纖維長度在不斷減短，逐漸被消化系統(tǒng)分解，甚至吸收。圖3（c）中蠶絲蛋白短纖維的長度大部分在40～60 μm，也有100 μm以上的長纖維存在，直徑大于10 μm;與圖3（b）對(duì)比來看，說明實(shí)驗(yàn)組的人工胃液對(duì)蠶絲蛋白短纖維的溶解力較強(qiáng)，胰蛋白酶對(duì)蠶絲蛋白也有一定的分解作用。

3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖4為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中蠶絲蛋白纖維在人工消化液作用后的蠶絲蛋白分子SDS凝膠電泳圖。從圖4可以看出，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的蛋白分子電泳圖中只有Mark標(biāo)準(zhǔn)蛋白的條帶，都沒有顯示出其他的蛋白條帶，說明蠶絲蛋白纖維在經(jīng)過人工胃液消化之后，未能分解成相對(duì)分子質(zhì)量為14.4～97.4 kDa的小分子蛋白，間接地說明蠶絲蛋白纖維在人工胃液中消化4.0 h后仍然為大分子蛋白。這是因?yàn)槿斯の敢褐械奈傅鞍酌赣袑Ｒ恍?，在特定的位點(diǎn)才會(huì)發(fā)生作用，不能水解復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的蠶絲纖維結(jié)晶區(qū)[14]。同時(shí)，也證明蠶絲蛋白短纖維經(jīng)過消化液的作用后是可以以百微米級(jí)的纖維態(tài)形狀到達(dá)小腸，且依然保持良好的疏水性，能起到膳食纖維添加劑的作用，也可以起到抗消化載體的效果。

3.4 粒徑分析

圖5為蠶絲蛋白短纖維經(jīng)過人工胃液消化作用后，在人工腸液中繼續(xù)消化4.0 h后的粒徑分布圖。從圖5可以看出，蠶絲蛋白短纖維的粒度分級(jí)在0.5～100 μm呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布，體積密度在粒度分級(jí)為12 μm左右達(dá)到最大值。說明經(jīng)過體外消化模擬實(shí)驗(yàn)以后，蠶絲蛋白纖維在人工胃液的消化作用下，由原來的1～3 mm的長度變?yōu)閹资綆装傥⒚浊伊礁〉睦w維。同時(shí)，由對(duì)數(shù)正態(tài)分布的特點(diǎn)可知，粒度分級(jí)在0.5～12 μm的體積密度和12～100 μm的體積密度相同，說明長度在12 μm左右的蠶絲蛋白短纖維數(shù)量居多，有一半以上的蠶絲蛋白纖維長度分布在12～100 μm。因此，蠶絲蛋白纖維在到達(dá)腸道時(shí)，其纖維長度主要分布在12 μm左右，且仍然為高分子蛋白的纖維狀態(tài)。

4 結(jié) 語

通過體外消化模擬實(shí)驗(yàn)，蠶絲蛋白纖維在人工胃液和人工腸液的消化作用下，蠶絲蛋白纖維依然呈纖維狀，且表面比較平整光滑，兩端呈不規(guī)則狀，粒徑在0.5～100 μm，并以12 μm為中線呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布。說明蠶絲蛋白纖維在人工消化液中不易分解，可以應(yīng)用在藥用材料或食用載體材料當(dāng)中，能很好地發(fā)揮其天然優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]封平. 蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)及食用性研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2004， 25（6）： 51-54.

FENG Ping. The study of structure and edidility of silk protein[J]. Food Research and Development， 2004， 25（6）： 51-54.

[2]劉凱， 匡大江， 王詩怡， 等. 蠶絲蛋白用作膠囊殼材料的研究[J]. 絲綢， 2018， 55（12）： 6-11.

LIU Kai， KUANG Dajiang， WANG Shiyi， et al. Study on silk protein used as capsule shell material[J]. Journal of Silk， 2018， 55（12）： 6-11.

[3]馬艷， 李智， 冉瑞龍， 等. 蠶絲在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用研究[J]. 材料導(dǎo)報(bào)， 2018， 32（1）： 86-90.

MA Yan， LI Zhi， RAN Ruilong， et al. Research on application of silk in biomaterial field[J]. Materials Reviews， 2018， 32（1）： 86-90.

[4]陳永峰， 鄭德宇， 郭聞師. 柞蠶絲素蛋白和殼聚糖復(fù)合材料的制備及其生物學(xué)特性[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 40（1）： 84-89.

CHEN Yongfeng， ZHENG Deyu， GUO Wenshi. Preparation of the artificial scaffold formed by tussah silk fibroin/chitosan and its biological properties research[J]. Journal of Wuhan University， 2019， 40（1）： 84-89.

[5]吳惠英， 周燕， 左保齊. 絲素蛋白纖維人工韌帶的制備及性能分析[J]. 絲綢， 2016， 53（7）： 1-6.

WU Huiying， ZHOU Yan， ZUO Baoqi. Preparation of artificial ligament with silk fibroin and analysis of its property[J]. Journal of Silk， 2016， 53（7）： 1-6.

[6]王鵬， 左保齊. 不同鹽/甲酸溶解體系下絲素膜的制備及性能表征[J]. 絲綢， 2016， 53（7）： 18-22.

WANG Peng， ZUO Baoqi. Preparation of silk fibroin films in different salt/formic acid dissolution system and its property characterization[J]. Journal of Silk， 2016， 53（7）： 18-22.

[7]徐亞梅， 李明忠. 蠶絲絲素蛋白材料在生物降解性能研究進(jìn)展[J]. 絲綢， 2011， 48（5）： 19-21.

XU Yamei， LI Mingzhong. Research progress of biodegradation properties of silkworm silk fibroin materials[J]. Journal of Silk， 2011， 48（5）： 19-21.

[8]MONDAL M， TRIVEDY K， KUMAR S N. The silk proteins， sericin and fibroin in silkworm， Bombyx mori Linn： a review[J]. Caspian Journal of Environmental Sciences， 2007， 5（2）： 63-76.

[9]吳惠英. 再生絲素蛋白纖維及其在生物醫(yī)用材料中的研究進(jìn)展[J]. 絲綢， 2017， 54（3）： 6-12.

WU Huiying. Research progress in regenerated silk fibroin fiber and its application in biomedical materials[J]. Journal of Silk， 2017， 54（3）： 6-12.

[10]ZUBIR N， PUSHPANATHAN K. Silk in biomedical engineering： a review[J]. International Journal of Engineering Inventions， 2016， 5（8）： 18-19.

[11]魏子凱， 丁紹敏， 陸敏興， 等. 蠶絲蛋白短纖維的制備方法[J]. 絲綢， 2019， 56（7）： 28-33.

WEI Zikai， DING Shaomin， LU Minxing， et al. Preparation methods of silk protein short fibers[J]. Journal of Silk， 2019， 56（7）： 28-33.

[12]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典： 三部[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China： Three[S]. Beijing： China Medical Science Press， 2015.

[13]張小平. 高分子量絲素蛋白的制備及其紡絲的研究[D]. 蘇州： 蘇州大學(xué)， 2014.

ZHANG Xiaoping. High Molecular Weight Silk Fibroin Used in Spinning[D]. Suzhou： Soochow University， 2014.

[14]任培華. 用酶水解結(jié)合鹽溶解的方法制備絲素肽[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2015， 41（4）： 768-772.

REN Peihua. Preparation of silk fibroin peptide by enzymatic hydrolysis combined with salt bath[J]. Science of Sericulture， 2015， 41（4）： 768-772.