呂春燕, 徐亞吉, 汪弋力, 丁維俊△, 姚唯一, 趙梓亦,張嬿

1成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (四川成都 610106); 成都中醫(yī)藥大學(xué) 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 3臨床醫(yī)學(xué)院(四川成都 610072)

核糖核酸是廣泛存在于各種生命體之中的遺傳信息載體，包括信使核糖核酸(mRNA)和微核糖核酸(miRNA)[1]等。mRNA作為信使分子，將基因組脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid， DNA)的遺傳信息傳遞至核糖體，指導(dǎo)核糖體合成肽鏈，實(shí)現(xiàn)遺傳信息向蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)化。miRNA參與調(diào)節(jié)發(fā)育、防御、造血、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等途徑[2-4]。mRNA和miRNA也存在于尿液中，可在一定程度上反映泌尿生殖道細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)。尿液的采集方便、無(wú)創(chuàng)，是一種理想的臨床檢測(cè)樣本，可用于泌尿生殖道等疾病的檢測(cè)[5]。如Bandyk等[6]報(bào)道了睪酮抑制前列腺信使-2 mRNA存在于尿液之中，可用于監(jiān)測(cè)相關(guān)細(xì)胞損傷的程度。目前，尿RNA檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷、預(yù)后和療效評(píng)價(jià)[7-8]。外泌體是由細(xì)胞合成并分泌的雙層膜性小囊泡[9-12]。尿外泌體主要由泌尿生殖道細(xì)胞分泌釋放到尿液中，可特異性反映膀胱、腎臟和前列腺等組織細(xì)胞的生理病理狀態(tài)[13-14]。外泌體脂質(zhì)雙分子層的包繞，對(duì)miRNA、mRNA等多種成分的穩(wěn)定性具有重要作用。因此，這些外泌體之中的某些標(biāo)志性成分，成為臨床標(biāo)志物研究熱點(diǎn)[15-16]。近年來(lái)，不管是對(duì)尿沉渣還是外泌體源RNA的研究均得到了極大的關(guān)注。但是，關(guān)注尿沉渣和尿外泌體源RNA之間差別的報(bào)道卻不多。本項(xiàng)研究對(duì)比分析了10例健康志愿者及10名腎纖維化患者的尿沉渣和尿外泌體中RNA的含量，以期發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定可靠的腎纖維化生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 樣品收集和處理 本研究經(jīng)過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有志愿者均被告知實(shí)驗(yàn)研究詳情并簽署知情同意書(shū)。收集2018年1月至2019年1月健康志愿者與腎纖維化患者各10例的第一或者第二次晨尿標(biāo)本。所有志愿者均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行常規(guī)體格檢查，以保證其健康狀態(tài)。10例腎纖維化患者為在1周內(nèi)經(jīng)腎活檢證實(shí)為腎纖維化的患者(小球類型不限)。所有研究對(duì)象的臨床和實(shí)驗(yàn)室資料見(jiàn)表1。健康志愿者男6例，女4例，年齡(41.42±10.32)歲；腎纖維化患者男3例，女7例，平均年齡(40.70±13.42)歲。每位受試者采集尿標(biāo)本20 mL，2 000 g離心10 min收集尿沉渣，加入Trizol提取沉渣RNA。上清液中加入適量聚乙二醇溶液，顛倒混勻，4℃靜置過(guò)夜，4 000×g離心1 h，收集管底沉淀，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS液)稀釋后分為二份，一份進(jìn)行電鏡和蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)；一份加入Trizol提取RNA。

表1 10例腎纖維化患者基礎(chǔ)疾病及纖維化程度表

1.2 qRT-PCR檢測(cè)尿沉渣和尿外泌體RNA 分別以snRNA-U6和β-actin為內(nèi)參基因，用Primer Premier V5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表2)，委托專業(yè)公司合成。Trizol法提取上述二種尿液成分的總RNA。按照M-MLV First Strand cDNASynthsis Kit (Omega Bio-TEK) 提供的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 cDNA 的合成。取 cDNA 以 SYBR? Green PCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，同一標(biāo)本另設(shè)2個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 s變性；60℃ 60 s退火加延伸，反應(yīng)60個(gè)循環(huán)。

表2 目的基因和內(nèi)參基因引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以同一標(biāo)本3次qRT-PCR檢測(cè)RNA的平均循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct值)對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行計(jì)算。以log2理論轉(zhuǎn)化平均Ct值，進(jìn)行倍數(shù)改變計(jì)算；以log10理論轉(zhuǎn)化平均Ct值，作為該樣品的正常讀數(shù)，進(jìn)行F檢驗(yàn)，確定RNA結(jié)果分布范圍。組間對(duì)比采用2-ΔCt理論，其中ΔCt=AvgCt目的RNA-AvgCt內(nèi)參基因。采用t檢驗(yàn)LSD法進(jìn)行計(jì)算。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿外泌體的鑒定 經(jīng)聚乙二醇富集的外泌體在電鏡下表現(xiàn)為類圓形雙層膜包繞囊泡，中央為低電子密度的凹陷區(qū)，大小介于30～120 nm之間，囊泡散在分布，部分聚集，背景散在小的沉淀物殘?jiān)?圖1-A)。Western blot方法檢測(cè)到外泌體特異性標(biāo)志物CD63和CD9(圖1-B)。

2.2 正常人尿沉渣和尿外泌體中RNA的表達(dá)水平 miR-21、U6、E-cadherin和Vimentin在尿外泌體中略高于尿沉渣中含量，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而miR-29 c和β-actin在尿外泌體中略低于尿沉渣中含量，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

注：A：外泌體電鏡圖(×15k)；B：外泌體標(biāo)志物Western blot檢測(cè)結(jié)果

表3 RNA 在尿外泌體和尿沉渣中表達(dá)水平及倍數(shù)改變

2.3 健康志愿者qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 所有健康志愿者，不管尿沉渣還是尿外泌體中miR-29c、miR-21和U6均可檢測(cè)到，而E-cadherin、Vimentin和β-actin在所有尿沉渣中均可檢測(cè)到，Vimentin在所有外泌體中均可檢測(cè)到，1例志愿者尿外泌體中E-cadherin和1例志愿者尿外泌體中β-actin未檢測(cè)到。以log10理論轉(zhuǎn)化正常的讀數(shù)，尿沉渣和尿外泌體中miR-29c、miR-21、U6和E-cadherin、Vimentin、β-actin的讀數(shù)值分布見(jiàn)圖2。兩組總體均數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。外泌體源miR-29c、miR-21和E-cadherin與尿沉渣中相應(yīng)RNA分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從圖2-A、B、D可以看出外泌體源miR-29c、miR-21和E-cadherin比尿沉渣中相應(yīng)RNA分布更一致，結(jié)果變異小，數(shù)值更加穩(wěn)定；外泌體源U6和vimentin、β-actin與尿沉渣中相應(yīng)RNA分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從圖2-C、E、F中可以看出外泌體源U6和vimentin、β-actin與尿沉渣中相應(yīng)RNA變異程度相當(dāng)。見(jiàn)表4。

2.4 腎纖維化患者樣品qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 所有腎纖維化患者，不管尿沉渣還是尿外泌體中miR-29c、miR-21和U6均可檢測(cè)到，而Vimentin和β-actin在所有尿沉渣中均可檢測(cè)到，E-cadherin、Vimentin和β-actin在所有外泌體中均可檢測(cè)到，2例腎纖維化患者尿沉渣中E-cadherin未檢測(cè)到。以log10理論轉(zhuǎn)化正常的讀數(shù)，尿沉渣和尿外泌體中miR-29c、miR-21、U6和E-cadherin、Vimentin、β-actin的讀數(shù)值見(jiàn)圖3、表5。兩組總體均數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。外泌體源miR-29c和E-cadherin與尿沉渣中相應(yīng)RNA分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從圖3-A、D可以看出外泌體源miR-29c和E-cadherin比尿沉渣中相應(yīng)RNA分布更一致，結(jié)果變異小，數(shù)值更加穩(wěn)定；外泌體源miR-21、U6和Vimentin、β-actin與尿沉渣中相應(yīng)RNA結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從圖3-B、C、E、F可以看出外泌體源miR-21、U6和Vimentin、β-actin與尿沉渣中相應(yīng)RNA結(jié)果變異程度相當(dāng)。

注：A：miR-29c；B：miR-21；C：U6；D：E-cadherin；E：Vimentin；F：β-actin

表4 健康志愿者尿沉渣和外泌體中RNAs表達(dá)水平情況

注：A:miR-29c；B:miR-21；C:U6；D:E-cadherin；E:Vimentin；F:β-actin

表5 腎纖維化患者尿沉渣和外泌體中RNAs讀數(shù)值分布情況

而miR-29c相對(duì)含量(相對(duì)于U6)的在尿外泌體和尿沉渣中分別介于0.034～0.107 7之間和0.005～0.067之間，前者高于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-21相對(duì)含量(相對(duì)于U6)在尿外泌體和尿沉渣中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。E-cadherin和Vimentin相對(duì)含量(相對(duì)于β-actin)在尿外泌體和尿沉渣中比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。

表6 腎纖維化患者尿沉渣和外泌體中RNAs相對(duì)含量情況

3 討論

本研究探討尿外泌體和尿沉渣中miRNAs和mRNAs表達(dá)的差異。從表達(dá)水平來(lái)看，盡管在健康志愿者尿沉渣和尿外泌體中miRNA和mRNA表達(dá)水平并不相同，但組間比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而從表達(dá)量的變異情況來(lái)看，外泌體源miR-29c、miR-21和E-cadherin與尿沉渣中相應(yīng)RNA結(jié)果卻差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而外泌體源U6和Vimentin、β-actin與尿沉渣中相應(yīng)RNA結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明外泌體源RNA表達(dá)量比尿沉渣RNA表達(dá)情況更穩(wěn)定，因此，具有更高的作為生物標(biāo)志物的潛力。

尿液是一種復(fù)雜的生物體液，?？煞蛛x為多種成分，尿沉渣和尿外泌體是其中的兩種重要成分。尿沉渣及尿外泌體中RNA已被廣泛用于診斷和治療腎臟疾病的生物標(biāo)志物。Zavesky等[17]發(fā)現(xiàn)婦科腫瘤患者miRNA在尿外泌體和尿上清液中表達(dá)程度不同。Dijkstra等[18]也發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌患者尿液中，外泌體作為一種穩(wěn)定物質(zhì)，可用于生物標(biāo)志物的分析，其診斷價(jià)值與細(xì)胞沉渣不同。Hendriks等[19]比較分析了全尿、細(xì)胞沉渣和外泌體中前列腺特異性標(biāo)志物PCA3和ERG的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在全尿中這些標(biāo)志物水平最高，且在數(shù)字直腸鏡檢查后升高更加明顯。與非前列腺癌患者相比，在前列腺癌患者中，PCA3和ERG在數(shù)字直腸鏡檢查后上述三種尿成分中均增高。Krishnamurthy等[20]發(fā)現(xiàn)外泌體源蛋白標(biāo)志物比全尿分析能夠更準(zhǔn)確地反映糖尿病腎病的潛在蛋白改變，用于糖尿病腎病的監(jiān)測(cè)。這些研究說(shuō)明，檢測(cè)不同的尿液成分具有不同的診斷價(jià)值。

腎纖維化是在各種腎臟疾病基礎(chǔ)上發(fā)生的腎小球或腎間質(zhì)內(nèi)膠原纖維等成分沉積形成，是慢性腎功能不全的重要病理基礎(chǔ)[21-22]。不論中藥、西藥，在早期腎纖維化形成階段，均有一定的治療效果[23-24]；但疾病發(fā)展到晚期，纖維化損害的腎臟幾乎沒(méi)有逆轉(zhuǎn)的可能。因此，疾病的早期診斷，尤其分子標(biāo)志物的診斷，起著越來(lái)越重要的作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-29c在尿沉渣和尿外泌體中明顯不同，這可能是因?yàn)樵诓唤】档膫€(gè)體，miRNA選擇外泌體進(jìn)行信號(hào)/物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的可能更大。因此，有必要對(duì)尿外泌體源miRNAs進(jìn)行檢測(cè)。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下不會(huì)發(fā)生表達(dá)改變的基因作內(nèi)參。U6和β-actin是組織和細(xì)胞miRNA和mRNA qRT-PCR檢測(cè)的公認(rèn)內(nèi)參基因之一，也常規(guī)沿用作外泌體源RNA的內(nèi)參基因。但本研究發(fā)現(xiàn)，β-actin在外泌體中的表達(dá)穩(wěn)定性并不高于其他基因，有幾例標(biāo)本外泌體源β-actin未檢測(cè)出，因此，有必要對(duì)外泌體源內(nèi)參基因進(jìn)行深入研究[25-26]。

總之，在本研究中，我們檢測(cè)和分析了尿外泌體和尿沉渣中的RNA(包括miRNA和mRNA)情況，這是第一次比較尿沉渣和尿外泌體中miRNA和mRNA的表達(dá)水平。我們的數(shù)據(jù)表明miRNA和mRNA在這兩種成分中相似，但尿外泌體中部分miRNA和mRNA相對(duì)更穩(wěn)定，腎纖維化患者尿外泌體中miR-29c表達(dá)量更高。這項(xiàng)研究可能為尿沉渣和尿外泌體源miRNA和mRNA的研究提供新的視角。