袁紅霞，秦粉菊，顧華杰

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展，越來越多的化學(xué)品被釋放到環(huán)境中。許多研究表明，一些化學(xué)品在環(huán)境中很難被降解，并可通過食物鏈在動物和人體組織中累積，引起內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[1-3]。辛基酚（4-tert-octylphenol，4-t-OP）是辛基酚聚氧乙烯醚的降解產(chǎn)物，也是重要的精細(xì)化工生產(chǎn)原料，廣泛用于生產(chǎn)非離子表面活性劑、石油添加劑、農(nóng)藥、涂料、增塑劑、除銹劑、潤滑油抗氧劑等[4-5]。因4-t-OP在生產(chǎn)生活中的廣泛使用，水體、土壤和空氣介質(zhì)中都有一定濃度4-t-OP的累積，且其在自然環(huán)境中很難降解[6-7]。4-t-OP 是一種親脂性化合物，可快速被生物體吸收并在脂肪組織中累積[8]。因結(jié)構(gòu)類似于雌激素，4-t-OP 已被確認(rèn)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，顯示類雌激素效應(yīng)[9-10]。

國內(nèi)外已有4-t-OP 影響水生和陸生動物生長發(fā)育的毒性效應(yīng)報道[10-13]。昆蟲是動物中物種數(shù)量最多、分布最廣泛、且對環(huán)境變化反應(yīng)敏感的無脊椎節(jié)肢動物。其中鱗翅目昆蟲多與農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)密切相關(guān)，研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對鱗翅目昆蟲的影響有十分重要的理論和實踐意義。據(jù)所查國內(nèi)外文獻(xiàn)，至今未見4-t-OP 對昆蟲影響的研究報道。家蠶（Bombyx moriL.）是國際無脊椎動物協(xié)會確認(rèn)的模式昆蟲，是理想的毒理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、疾病模型替代動物研究材料之一[14-15]。為此，本文以鱗翅目模式昆蟲家蠶為試驗對象，研究了4-t-OP 對家蠶生長發(fā)育的影響，旨在為探討酚類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對鱗翅目昆蟲生長發(fā)育的干擾機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料，同時為昆蟲等無脊椎動物生態(tài)環(huán)境的保護(hù)與治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗昆蟲為人工飼料攝食性很好的家蠶皓月品種，具有遺傳和發(fā)育的高度一致性。原種由江蘇省蠶種公司提供。4-t-OP（純度99%）購自Sigma-Aldrich公司。分析純無水乙醇購自上海生工生物工程有限公司。純桑葉粉人工飼料購自山東蠶業(yè)研究所。

1.2 藥物添加方法

用無水乙醇配制20 g·L-1的4-t-OP 母液，取適量4-t-OP母液與飼料干粉梯級混合法混合，加水充分拌勻，裝入保鮮袋后放進(jìn)飯盒內(nèi)高溫滅菌（120 ℃，20 min），低溫冷藏（4 ℃）。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，實驗設(shè)4-t-OP 濃度為0（對照）、0.01、0.02、0.04 g·kg-1和0.08 g·kg-15 個處理，各處理均設(shè)3 次重復(fù)，每次重復(fù)飼養(yǎng)50頭蠶。

1.3 昆蟲飼養(yǎng)

蠶卵在22～25 ℃，相對濕度（Relative humidity，RH）75%～85%，24 h光照條件下保護(hù)至孵化。家蠶幼蟲生長發(fā)育經(jīng)過4 眠5 個齡期，由卵剛孵化出的幼蟲形狀似螞蟻，稱蟻蠶。蟻蠶添食后稱1齡蠶，第1眠后稱2 齡蠶，第2 眠后稱3 齡蠶，第3 眠后稱4 齡蠶，第4眠后稱5 齡蠶，每眠1 次蛻皮1 次。蠶卵孵化后，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)。家蠶幼蟲飼養(yǎng)方法為：1～3齡，27 ℃、RH 80%～85%；4～5 齡，25 ℃、RH 75%～80%。家蠶全齡（1～5齡）使用實驗要求的含一定濃度的4-t-OP 人工飼料添食，1 齡每3 日添食1 次，2～4 齡每2日添食1次，5齡每日1次更換人工飼料。每次起蠶后4 h 左右餉食。逐條蠶適熟上簇（開始吐絲結(jié)繭），25 ℃、RH 75%～80%條件下紙盒內(nèi)單獨(dú)結(jié)繭，保護(hù)至成蟲羽化。

1.4 生長發(fā)育調(diào)查

收蟻后，調(diào)查家蠶24 h 疏毛率（剛毛舒展蠶的百分率）、48 h轉(zhuǎn)色率（體色轉(zhuǎn)變個體的百分率）、家蠶發(fā)育速度（幼蟲期和蛹期發(fā)育經(jīng)過時間）、體質(zhì)量變化（1～4 齡眠蠶和5 齡期家蠶1～7 日）和蛹期繭層質(zhì)量。24 h 疏毛率和48 h 轉(zhuǎn)色率調(diào)查每處理3×50 頭。體質(zhì)量調(diào)查中為了避免家蠶進(jìn)食的影響，調(diào)查各齡（1～4齡）見起時（出現(xiàn)蛻皮蠶）的10 頭眠蠶體質(zhì)量。為了解最大生長量變化，分別調(diào)查5 齡雌雄家蠶每日體質(zhì)量（各10 頭）。在上簇后第8 d，調(diào)查各處理組蠶繭的全繭量和繭層量，并計算繭層率。

1.5 生命力調(diào)查

家蠶生命力調(diào)查以3 齡起蠶絕食生命時數(shù)、4 齡起蠶結(jié)繭率、蠶繭的死籠率（生命力相關(guān)的死亡率）和羽化率表示。在25 ℃、RH 75%～80%下每個處理取3×10頭3齡起蠶放入消毒培養(yǎng)皿中，逐頭記錄家蠶饑餓死亡時間，作為3 齡起蠶絕食生命時數(shù)。每個處理取3×30 頭4 齡起蠶，統(tǒng)計結(jié)繭蠶數(shù)，計算4 齡起蠶結(jié)繭率；開始結(jié)繭后第8 d，所結(jié)蠶繭全部剖開，統(tǒng)計良蛹數(shù)量，計算死籠率。羽化率指家蠶正常變態(tài)為成蟲的蠶蛹占調(diào)查蠶蛹數(shù)的百分率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件和Excel 2010。

2 結(jié)果與討論

2.1 4-t-OP對家蠶生長發(fā)育的影響

2.1.1 4-t-OP對蟻蠶疏毛率和轉(zhuǎn)色率的影響

家蠶蟻蠶（1 齡幼蟲）體表生有較多瘤狀突起，其上著生剛毛，開始取食后體表剛毛隨著體壁的伸展在表皮散開，呈疏毛癥狀，不同時間剛毛舒展的程度不同，蠶體色也趨淡，此時通稱“疏毛期”[16]。給蟻蠶添食4-t-OP 24 h 后調(diào)查疏毛率，48 h 后調(diào)查轉(zhuǎn)色率（圖1）。4-t-OP 添食處理對蟻蠶的疏毛率和轉(zhuǎn)色率有濃度效應(yīng)，0.01 g·kg-14-t-OP 添食處理，蟻蠶24 h 疏毛率和48 h轉(zhuǎn)色率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；0.02～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組蟻蠶24 h 疏毛率和48 h 轉(zhuǎn)色率與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其中0.08 g·kg-14-t-OP 添食組蟻蠶24 h 疏毛率和48 h 轉(zhuǎn)色率分別較對照組下降了60.0%和43.3%。

圖1 4-t-OP對家蠶1齡幼蟲疏毛率和轉(zhuǎn)色率的影響Figure 1 Effects of 4-t-OP on percentage of setae dispersion and body color change in 1st instar larvae

2.1.2 4-t-OP對家蠶發(fā)育速度的影響

由圖2 可見，0.01～0.02 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲發(fā)育經(jīng)過時間與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但蛹期發(fā)育經(jīng)過時間比對照組顯著延長（P＜0.01）；而0.04 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲發(fā)育經(jīng)過時間和蛹期發(fā)育經(jīng)過時間都比對照組顯著延長（P＜0.05 和P＜0.01）。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶的幼蟲期與對照組相比有顯著差異（P＜0.01），幼蟲期整段發(fā)育時間比對照組延長了17.7%。0.08 g·kg-14-t-OP添食組蠶體質(zhì)虛弱，蠶體大小出現(xiàn)明顯開差，開始吐絲后第8 日仍然未化蛹，最后全部成為死籠或不結(jié)繭蠶，無法完成整個世代。

2.1.3 4-t-OP對家蠶體質(zhì)量的影響

圖2 4-t-OP對家蠶生長發(fā)育速度的影響Figure 2 Effects of 4-t-OP on the growth and development velocity of silkworm,Bombyx mori

圖3 4-t-OP對1～4齡家蠶幼蟲眠蠶體質(zhì)量的影響Figure 3 Effects of 4-t-OP on the weight of dormant silkworm in the 1stto 4th instar larvae

圖3 為不同濃度4-t-OP 處理家蠶幼蟲1～4 齡眠蠶體質(zhì)量的變化。0.01 g·kg-14-t-OP 添食組1～4 齡幼蟲眠蠶的體質(zhì)量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；0.02 g·kg-14-t-OP 添食組1～3齡幼蟲眠蠶的體質(zhì)量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），4 齡眠蠶的體質(zhì)量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；0.04 g·kg-14-t-OP 添食組1 齡幼蟲眠蠶的體質(zhì)量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），2～4 齡眠蠶的體質(zhì)量與對照組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01）；0.08 g·kg-14-t-OP添食組1～4 齡幼蟲眠蠶的體質(zhì)量都較對照組體質(zhì)量低，與對照組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01），0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶至4 齡時眠蠶體質(zhì)量只有對照組的61.6%。從入眠速度看，0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶從1 齡開始家蠶見眠時間都較對照組延長，而且組內(nèi)個體入眠時間開差大、發(fā)育不齊。說明4-t-OP 對家蠶稚蠶的生長發(fā)育影響相對較小，但至大蠶期4-t-OP 的抑制作用逐步顯現(xiàn)，并且有濃度效應(yīng)，4-t-OP 添食會影響家蠶的發(fā)育整齊度和發(fā)育速度，進(jìn)而影響家蠶個體體質(zhì)量。

為研究4-t-OP 對家蠶最大生長量的影響，進(jìn)一步調(diào)查了5齡期家蠶每日體質(zhì)量的變化（圖4）。家蠶幼蟲期一直添食4-t-OP，0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組5 齡雄性和雌性家蠶體質(zhì)量都分別比對照組雄雌家蠶體質(zhì)量下降，且4-t-OP 對5 齡家蠶幼蟲體質(zhì)量增加的抑制作用濃度效應(yīng)明顯。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP添食組家蠶5齡第1 d雌蠶體質(zhì)量與對照組雌蠶體質(zhì)量相比有所降低，但都沒有顯著差異（P＞0.05），0.08 g·kg-14-t-OP 添食組5 齡第1 d 雌蠶體質(zhì)量與對照組雌蠶體質(zhì)量相比顯著降低（P＜0.05）；0.01～0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶5齡第2～7 d雌蠶體質(zhì)量與對照組雌蠶體質(zhì)量相比都顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖4b）。0.04～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶5齡第1～7 d雄蠶體質(zhì)量與對照組雄蠶體質(zhì)量相比都顯著降低（P＜0.01）（圖4a）。0.08 g·kg-14-t-OP添食組5 齡雄蠶第7 d 體質(zhì)量比對照組雄蠶體質(zhì)量降低44.1%，5齡雌蠶第7 d體質(zhì)量比對照組雌蠶體質(zhì)量降低52.2%。由圖4 可見，4-t-OP 添食組雄蠶5 齡后期體質(zhì)量停止增長的時間比對照組雄蠶早，5 齡雌蠶也有類似結(jié)果，4-t-OP 添食組家蠶幼蟲比對照組家蠶成熟早。

4-t-OP 對家蠶幼蟲群體發(fā)育整齊度和體質(zhì)量增長的影響在低齡期（1～3 齡）不明顯，至大蠶期（4～5齡）影響加重，表明4-t-OP 在家蠶體內(nèi)可能有累積作用，對家蠶生長發(fā)育的影響具有濃度-時間效應(yīng)。這同袁紅霞等[17]報道的環(huán)境激素壬基酚對家蠶生長發(fā)育毒性具有濃度-時間效應(yīng)，鐘儒杰等[18]報道的環(huán)境激素鄰苯二甲酸丁基芐酯對家蠶具有明顯的毒害作用，可顯著抑制家蠶的體質(zhì)量和存活率，在蠶體內(nèi)具有累積效應(yīng)等結(jié)果類似。以上也說明環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對家蠶的生長發(fā)育毒性可能存在相似性。同時Yuan 等[19-20]研究表明壬基酚對家蠶的毒性與家蠶抗氧化保護(hù)酶活性和蛻皮激素受體基因表達(dá)有關(guān),壬基酚對家蠶生殖發(fā)育具有毒性，但4-t-OP 是否也與上述壬基酚一樣能影響家蠶酶活性等還有待進(jìn)一步研究證實。

2.1.4 4-t-OP對家蠶全繭量和繭層率的影響

圖4 4-t-OP對5齡家蠶體質(zhì)量的影響Figure 4 Effects of 4-t-OP on the weight of silkworm in the fifth instar larvae

圖5 4-t-OP對家蠶全繭量和繭層率的影響Figure 5 Effects of 4-t-OP on the cocoon weight and the cocoon shell ratio of silkworm，Bombyx mori

在家蠶上蔟后第8 d，分別調(diào)查雌蠶與雄蠶全繭量和繭層率（圖5）。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP 添食組雌蠶與雄蠶全繭量均比對照組蠶全繭量低，4-t-OP添食組雌蠶全繭量與對照組雌蠶全繭量相比差異不顯著，而0.04 g·kg-14-t-OP添食組雄蠶全繭量較對照組雄蠶全繭量顯著降低（P＜0.05）（圖5a）。4-t-OP 對家蠶全繭量這一重要經(jīng)濟(jì)性狀的影響主要表現(xiàn)為降低了雄蠶全繭量。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP 添食組雌蠶與雄蠶繭層率均低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），雄蠶繭層率高于雌蠶繭層率（圖5b）。0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶幼蟲期全部不能結(jié)繭。

吐絲結(jié)繭是家蠶的本能之一，1～5 齡期家蠶絲腺細(xì)胞會隨著蠶體發(fā)育和器官快速生長而一起生長。幼蟲期攝食4-t-OP 的家蠶，隨著生長發(fā)育被抑制，其吐絲結(jié)繭生理功能也受到影響，4-t-OP 一定程度阻礙了絲物質(zhì)的形成和分泌。內(nèi)分泌的異常容易產(chǎn)生不結(jié)繭蠶，在4 齡摘除咽側(cè)體，20～30 h 后再移植咽側(cè)體，可造成絲腺退化；5 齡期用保幼激素添食，由于用量和添食時期不適當(dāng)，生理功能發(fā)生紊亂會造成不結(jié)繭蠶[16]。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲期全部不能結(jié)繭，表明4-t-OP 對家蠶正常的吐絲結(jié)繭生理功能和行為有毒害作用，因此推測4-t-OP 作為一種具有類雌激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，通過干擾家蠶的內(nèi)分泌，影響生理功能，使其生長發(fā)育速度減慢和蠶繭產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時不能吐絲結(jié)繭并死亡。

2.2 4-t-OP對家蠶生命力的影響

2.2.1 4-t-OP對家蠶3齡起蠶絕食生命時數(shù)的影響

食下高濃度4-t-OP 會嚴(yán)重削弱1～2 齡稚蠶的體質(zhì)，家蠶幼蟲的生命力下降。隨著4-t-OP添食濃度的增加，家蠶3 齡起蠶絕食生命時數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，0.04～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶3 齡起蠶絕食生命時數(shù)與對照組相比都顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。其中0.08 g·kg-14-t-OP添食組3齡起蠶絕食生命時數(shù)只有對照組的32.5%（圖6）。

2.2.2 4-t-OP 對家蠶4 齡起蠶結(jié)繭率、死籠率和羽化率的影響

圖6 4-t-OP對家蠶3齡起蠶絕食生命時數(shù)的影響Figure 6 Effects of 4-t-OP on the fasting survival hours of the newly molted 3rd instar larvae

圖7 4-t-OP對家蠶4齡起蠶結(jié)繭率、死籠率和羽化率的影響Figure 7 Effects of 4-t-OP on the percentage of cocoon,death pupa and adult of the 4thnewly molted larvae

4-t-OP 對家蠶4 齡起蠶結(jié)繭率、死籠率和羽化率有濃度效應(yīng)（圖7）。0.01 g·kg-14-t-OP 添食組4齡起蠶結(jié)繭率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但0.02～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組4 齡起蠶結(jié)繭率都比對照組極顯著降低（P＜0.01），其中0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶幼蟲期全部不能結(jié)繭。表明0.02 g·kg-1以上濃度4-t-OP 對家蠶幼蟲吐絲結(jié)繭功能有嚴(yán)重不良影響。家蠶4 齡起蠶死籠率隨4-t-OP 處理濃度增加而增加，羽化率隨4-t-OP 處理濃度增加而降低。表明家蠶整個幼蟲期飼料中添加4-t-OP 在蠶體內(nèi)有累積效應(yīng)，對家蠶蛻皮、結(jié)繭、化蛹和羽化等變態(tài)發(fā)育影響有時間和濃度效應(yīng)。4-t-OP 對家蠶發(fā)育的影響在化蛹和羽化的發(fā)育變態(tài)期更加明顯，濃度效應(yīng)比幼蟲期更加明顯，這進(jìn)一步提示4-t-OP對家蠶生長發(fā)育的影響具有時間效應(yīng)，其在家蠶體內(nèi)可能有累積作用。

4-t-OP 是一種具有類雌激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，在高等動物中與雌激素受體具有一定的親和力，通過干擾內(nèi)分泌活動影響動物的生長發(fā)育[21]。家蠶的變態(tài)發(fā)育是形態(tài)和生理的轉(zhuǎn)變過程，由腦、前胸腺及咽側(cè)體等內(nèi)分泌器官所分泌的激素來調(diào)控。體內(nèi)保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（Molting hormone，MH）的有無或高低直接調(diào)控了家蠶的生長發(fā)育[16]。家蠶結(jié)繭后化蛹和羽化困難，死籠率顯著升高，羽化率明顯下降，4-t-OP 是否也通過干擾JH和MH 或相關(guān)的激素受體合成而影響家蠶由幼蟲通過蛹期發(fā)育為成蟲的變態(tài)發(fā)育過程仍有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

（1）家蠶幼蟲期添食0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 能夠嚴(yán)重抑制家蠶的生長發(fā)育，對家蠶幼蟲生長發(fā)育、化蛹和羽化發(fā)育變態(tài)期影響具有濃度和時間效應(yīng)。

（2）家蠶幼蟲期攝食0.01～0.08 g·kg-14-t-OP，幼蟲的生命力和吐絲結(jié)繭功能下降，4-t-OP 阻礙絲物質(zhì)的形成。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲期全部不能結(jié)繭。