李基旭 趙文敬 韓學(xué)吉*

(1.延邊朝鮮族自治州疾病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133001；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133001)

登革熱是一種以急性發(fā)熱為主要癥狀的蚊媒傳染病，該病廣泛流行于東南亞、中南美洲和非洲100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)(Bhattetal., 2013)，是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。登革病毒(Dengue virus, DV)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型血清型(Srikiatkhachornetal., 2011)。我國(guó)把登革熱列為乙類(lèi)法定傳染病報(bào)告和管理。近年來(lái)，隨著出國(guó)務(wù)工人員的增多，吉林省延邊朝鮮族自治州(延邊州)時(shí)常發(fā)生輸入性登革熱病例，并且延邊州又地處中國(guó)、朝鮮、俄羅斯三國(guó)交界，出入境口岸較多，給登革熱疫情防控帶來(lái)較大壓力。之前，延邊州一直只采用臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)對(duì)登革熱進(jìn)行診斷，該標(biāo)準(zhǔn)在控制輸入性疫情方面存在較多局限性，無(wú)法對(duì)病毒分型，也無(wú)法進(jìn)行病毒溯源分析。為了探索更為準(zhǔn)確的登革熱診斷方法，并監(jiān)控病毒來(lái)源，我們開(kāi)展了此次研究，現(xiàn)把結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源

劉某，男，48歲，吉林省延邊州汪清縣人，2019年9月5日到柬埔寨務(wù)工，2019年9月22日回國(guó)就醫(yī)。

1.2 主要儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(ABI7500，美國(guó))、PCR擴(kuò)增儀(ABI9700，美國(guó))、組織核酸提取試劑盒(中國(guó)江蘇碩世生物科技公司)、登革病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒(中國(guó)江蘇碩世生物科技公司)、Accu Power one step RT-PCR Pre-Mix(BIONEER，韓國(guó))。引物由中國(guó)上海生工生物工程公司合成。

1.3 登革病毒熒光定量RT-qPCR檢測(cè)

登革病毒RNA提取和檢測(cè)均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 登革病毒基因片段擴(kuò)增

按照《全國(guó)登革熱監(jiān)測(cè)方案(試行)》(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，2005)指定的引物序列擴(kuò)增登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型目標(biāo)片段，詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為上下游引物(濃度：10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，配制20 μL體系。反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 登革病毒型特異性引物

1.5 基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并使用DNAStar軟件進(jìn)行校正，得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登革病毒序列進(jìn)行一致性分析，并用Mega5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查，該患者在柬埔寨務(wù)工期間，在當(dāng)?shù)毓づ锞幼　?019年9月20日開(kāi)始突然出現(xiàn)發(fā)熱、畏寒等癥狀，9月22日癥狀嚴(yán)重，出現(xiàn)頭痛、眼眶痛、關(guān)節(jié)痛等癥狀，遂回國(guó)就醫(yī)。該患者在發(fā)病前 15 d內(nèi)有蚊蟲(chóng)叮咬史，并就醫(yī)前未使用過(guò)任何藥物。查體：后背有明顯的皮疹和皮下出血點(diǎn)。入院血常規(guī)檢測(cè)：白細(xì)胞為2.7× 109/L；血小板為35×109/L；尿蛋白+；單核細(xì)胞百分比為12%。按照《全國(guó)登革熱監(jiān)測(cè)方案(試行)》診斷標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，2005)，可以診斷為登革熱臨床診斷病例。2019年9 月22日采集患者全血1份。

2.2 登革病毒檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR檢測(cè)，該患者血樣顯示為登革病毒陽(yáng)性。經(jīng)四種型別登革病毒RT-PCR擴(kuò)增，在登革病毒Ⅰ型490 bp 處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，未見(jiàn)有其他型特異性產(chǎn)物，詳見(jiàn)圖1。

圖1 吉林延邊州1例輸入性登革熱病例登革病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

將所得登革病毒Ⅰ型擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到了長(zhǎng)度為428 bp 的基因序列(登錄號(hào)：MN611473)。把此基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中默認(rèn)基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因序列與2017年越南登革熱疫情暴發(fā)中發(fā)現(xiàn)的登革病毒Ⅰ型基因序列(登錄號(hào)：LC428079)同源性最高，達(dá)到了99%(424/428)；與同源性較高的部分登革病毒Ⅰ型基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其基因序列與越南病毒株101-TN-056(LC428079)和111-HD-004(LC428054)基因序列處于一個(gè)分枝，詳見(jiàn)圖2。

圖2 吉林延邊州1例輸入性登革熱病例登革病毒基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

目前，隨著全球氣候的變化，登革熱疫情呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)，過(guò)去50年全球疫情上升30倍(劉美辰等，2014)。對(duì)于中國(guó)登革熱疫情，專(zhuān)家認(rèn)為“我國(guó)登革熱疫情是由輸入病例引起本地病例的暴發(fā)及流行”(劉起勇，2020)。延邊州位于中國(guó)、朝鮮、俄羅斯三國(guó)交界，邊境線較長(zhǎng)。延邊州雖然沒(méi)有本地登革熱病例報(bào)告，但時(shí)常發(fā)生本地赴東南亞務(wù)工、旅游、從商人員在當(dāng)?shù)仡净嫉歉餆岷蠡貒?guó)的現(xiàn)象，導(dǎo)致延邊州時(shí)而出現(xiàn)輸入性登革熱散發(fā)疫情。據(jù)國(guó)內(nèi)學(xué)者調(diào)查，延邊州有多種伊蚊分布(劉國(guó)平等，2012)，而且臨近國(guó)家蚊蟲(chóng)分布和登革熱疫情始終不明，不能排除登革熱疫情通過(guò)媒介伊蚊跨境傳播的可能性。在蚊蟲(chóng)繁殖高峰季節(jié)，這些因素很可能促發(fā)輸入性登革熱疫情在本地蔓延。因此在吉林省延邊州要做好登革熱病例的早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早診斷、早隔離、早治療，尤其在病例診斷上要采取更加有效、更加精確的方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在登革熱的診斷中，發(fā)病早期的病例應(yīng)采用比抗體檢測(cè)更為靈敏的檢測(cè)方法(陽(yáng)帆等，2012)。目前，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷,使診斷更為精準(zhǔn)(王宇平等，2010)。為了精準(zhǔn)防控輸入性登革熱疫情，提升預(yù)警能力，我們采用病毒基因擴(kuò)增和序列分析方法，首次在本地確診了1例輸入性登革熱病例，并判定了病毒型別和輸入來(lái)源，為流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。結(jié)果顯示，該病例在柬埔寨務(wù)工期間有明確的蚊蟲(chóng)叮咬史，其臨床癥狀和輔助檢查結(jié)果符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以確定為臨床診斷病例。經(jīng)登革病毒實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性，進(jìn)一步確認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室確診病例。經(jīng)基因序列擴(kuò)增和同源性分析，確認(rèn)該輸入性登革熱病例為登革病毒Ⅰ型感染，病毒來(lái)源于2017年越南登革熱疫情暴發(fā)。