萬 靜，陳曉蘭，楊曉梅，楊敬鴻，陳 瑤，楊芳芳，繆艷燕

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 畢節(jié) 551700)

芙蓉乳腺寧凝膠膏劑是本課題組正在研制的一種治療急性乳腺炎的新型經(jīng)皮給藥制劑。該制劑具有避免肝臟首過效應(yīng)、維持恒定血藥濃度、作用持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)勢(shì)。但通常情況下，經(jīng)皮給藥難以透過皮膚天然屏障，到達(dá)病灶部位起到治療作用。在劑型中加入促滲劑能夠有效解決這一難題，透皮促滲劑主要是通過幫助藥物穿過角質(zhì)層和表皮來增加藥物透皮速率、累計(jì)透皮量，篩選合適的促滲劑也是外用藥的關(guān)鍵[1]。本實(shí)驗(yàn)以芙蓉乳腺寧凝膠膏劑中主要成分穿心蓮內(nèi)酯為指標(biāo)，從常用的促滲劑氮酮、薄荷腦、丙二醇中篩選出較佳的促滲劑及濃度，為優(yōu)選芙蓉乳腺寧凝膠膏劑促滲劑提供參考。

1 材料

1.1 試藥

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：L-001-160520，純度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；硝酸纖維素膜(批號(hào)：20181227，南京宏哲生物科技有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(批號(hào)：Y17D9S77792，源葉生物)；氮酮(批號(hào)：20140517，鄭州益康化工有限公司)；薄荷腦(批號(hào)：201803，云天藥業(yè))；丙二醇(批號(hào)：170926，西隴化工股份有限公司)；聚乙二醇400(批號(hào)：1410201，西隴化工股份有限公司)。

1.2 儀器

RYJ-12B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；1260型高效液相色譜儀(安捷倫)；DKZ-5A水浴恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定

2.1.1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液的配制

精密稱取0.004 41g穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，置干燥的10 mL容量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，放冷，定容至刻度，搖勻，制得1 mL含0.4410 mg穿心蓮內(nèi)酯的對(duì)照品溶液。精密量取1 mL 0.441 mg·mL-1穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制得1 mL含穿心蓮內(nèi)酯0.0441 mg的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的配制

將制備好的芙蓉乳腺寧凝膠膏劑剪成面積為2.80 cm2，加50 mL 70%乙醇超聲1 h，放冷，補(bǔ)重，過濾，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Dikma-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈：0.2%的磷酸水(25∶75)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：225 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4 專屬性考察

分別取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品、供試品溶液和不含穿心蓮純化物的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯分離度好，且在出峰處無干擾，見圖1。

A.對(duì)照品；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液；1.穿心蓮內(nèi)酯。圖1 穿心蓮內(nèi)酯的HPLC色譜Fig．1 HPLC chromatograms of andrographolide

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取2 mL 0.441 mg·mL-1穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋定容至10 mL，制得1 mL含穿心蓮內(nèi)酯0.088 2 mg的對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下依次進(jìn)樣1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，記錄穿心蓮內(nèi)酯峰面積(Y)，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得到穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=2088.4X+2.5565(r=0.9999)，結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯在0.0882～1.764 μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取同一濃度(0.044 1 mg·mL-1)的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄穿心蓮內(nèi)酯峰面積，其RSD值為0.83%，說明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，室溫下于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按“2.1.3”項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄穿心蓮內(nèi)酯峰面積，其RSD值為1.20%，說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯含量，其RSD值為2.82%，說明該方法重復(fù)性好。

2.1.9 加樣回收試驗(yàn)

取已知穿心蓮內(nèi)酯含量的芙蓉乳腺寧凝膠膏劑6份，精密稱定，分別加入穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品1.5657 mg，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試液，“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯的平均回收率為101.71%，RSD為1.66%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 芙蓉乳腺寧凝膠膏劑促滲劑的篩選

2.2.1 接收介質(zhì)的篩選

分別配制生理鹽水，10%乙醇生理鹽水，30%PEG400乙醇生理鹽水與PEG400∶乙醇∶生理鹽水(3∶3∶4)作為接收介質(zhì)。

稱取過量木芙蓉葉與穿心蓮純化物于10 mL離心管中，加入2 mL“2.2.1”項(xiàng)下不同的接收介質(zhì)，密封，渦旋10 min，使純化物充分混合均勻。置于37 ℃恒溫震蕩槽中震蕩24 h，使純化物溶解達(dá)到平衡。上述平衡液于離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速10000 r·min-1，取上清液0.1 mL，加甲醇稀釋定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄穿心蓮內(nèi)酯峰面積，計(jì)算其在上述接收介質(zhì)中的濃度，結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯在各接受介質(zhì)中的飽和濃度Tab.1 Saturated concentration of andrographolide in each receiving medium

由表1可知，一貼芙蓉乳腺寧凝膠膏劑中穿心蓮內(nèi)酯的總量為3.1313 mg，6.5 mL生理鹽水、10%乙醇生理鹽水、30%PEG400乙醇生理鹽水、PEG400∶乙醇∶生理鹽水(3∶3∶4)含穿心蓮內(nèi)酯的量依次為15.7346 mg、16.9670 mg、29.7596 mg、59.2001 mg，PEG400∶乙醇∶生理鹽水(3∶3∶4)作為接收介質(zhì)時(shí)能滿足穿心蓮內(nèi)酯的漏槽條件，因此，以PEG400∶乙醇∶生理鹽水(3∶3∶4)為接收介質(zhì)[2]。

2.2.2 透皮屏障的制備

將0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜剪為面積4 cm2左右，放置燒杯中，用肉豆蔻酸異丙酯浸泡24 h，取出，用干凈濾紙輕輕擦拭表面多余液體，備用。

2.2.3 體外透皮試驗(yàn)及計(jì)算參數(shù)

將“2.2.2”項(xiàng)下制備的硝酸纖維素膜固定于Franz擴(kuò)散池的接收池與供給池之間，接收池放置顆粒大小的磁力攪拌子，注入6.5 mL接收介質(zhì)(使用前超聲脫氣20 min)，供給池中給予固定大小(2.8 cm2)的芙蓉乳腺寧凝膠膏劑，確保接收介質(zhì)與透皮屏障間無氣泡存在。調(diào)節(jié)水浴溫度至37±1 ℃，磁力攪拌速度300 r·min-1，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分別取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)入同量等溫的空白接收介質(zhì)。將取的接收液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，按公式計(jì)算其單位面積累計(jì)滲透量(Q)、透皮速率常數(shù)(Jss) 和增滲倍數(shù)( enhancing rate，ER)[3]，以各時(shí)間點(diǎn)穿心蓮內(nèi)酯單位面積累計(jì)滲透量(Q)對(duì)時(shí)間(t)進(jìn)行方程擬合。

式中，Qn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)單位面積累計(jì)滲透量，Cn為第n個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度，V為Franz擴(kuò)散池接收池中的總體積(6.5 mL)，Ci為第i(i≤n-1)個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，Vi為實(shí)際取樣的體積(2 mL)，A為有效擴(kuò)散面積(2.80 cm2)，Jss促滲劑為經(jīng)加促滲劑處理后透皮速率常數(shù)，Jss空白為未加入促滲劑的透皮速率常數(shù)[4]，透皮速率常數(shù)為Q-t方程中直線斜率。

2.2.4 促滲劑的篩選

以穿心蓮內(nèi)酯24 h單位面積累計(jì)滲透量為指標(biāo)，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以0.5%、1%、3%氮酮，3%、5%、7%、9%薄荷腦，1%、3%、5%丙二醇為單一促滲劑，1.5%薄荷腦+1.5%丙二醇、1.5%氮酮+1.5%丙二醇、1%氮酮+7%薄荷腦、1%氮酮+3%丙二醇、7%薄荷腦+3%丙二醇為混合促滲劑，分別制備不含促滲劑芙蓉乳腺寧凝膠膏劑(空白)及含不同促滲劑的芙蓉乳腺寧凝膠膏劑。按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行透皮試驗(yàn)，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯Q24h、Jss、ER等參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 芙蓉乳腺寧凝膠膏劑促滲劑的篩選Tab.2 Comparison of penetration enhancers for FurongRuxianning gel ointment

結(jié)果表明，單一促滲劑中，3%氮酮、3%薄荷腦對(duì)穿心蓮內(nèi)酯透皮有抑制作用。薄荷腦的促滲效果與濃度有正相關(guān)關(guān)系，促滲效果：9%薄荷腦>7%薄荷腦>5%薄荷腦>3%薄荷腦，氮酮的促滲效果為：1%氮酮>0.5%氮酮>3%氮酮，丙二醇的促滲效果為：3%丙二醇>1%丙二醇>5%丙二醇?；旌洗贊B劑中，1.5%薄荷腦+1.5%丙二醇對(duì)穿心蓮內(nèi)酯有抑制作用，混合促滲劑促滲效果依次為：1%氮酮+7%薄荷腦>7%薄荷腦+3%丙二醇>1%氮酮+3%丙二醇>1.5%氮酮+1.5%丙二醇>1.5%薄荷腦+1.5%丙二醇。

由穿心蓮內(nèi)酯24 h單位面積累計(jì)滲透量可知，3%丙二醇對(duì)穿心蓮內(nèi)酯促滲效果較好，24 h單位面積累計(jì)滲透量為513.475 μg·cm-2，增滲倍數(shù)為1.32。

2.2.5 芙蓉乳腺寧凝膠膏劑體外透皮行為

將含3%丙二醇促滲劑的芙蓉乳腺寧凝膠膏劑透皮數(shù)據(jù)進(jìn)行零級(jí)方程、一級(jí)方程以及Higuchi方程擬合[5]，結(jié)果見表3。

表3 芙蓉乳腺寧凝膠膏劑方程擬合Tab.3 Equation fitting of Furong Ruxianning gel ointment

結(jié)果表明，擬合方程中零級(jí)方程相關(guān)系數(shù)最高，芙蓉乳腺寧凝膠膏劑中穿心蓮內(nèi)酯的體外經(jīng)皮滲透符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，芙蓉乳腺寧凝膠膏劑能均勻持續(xù)釋放藥物，有利于藥物在體內(nèi)維持平緩的血藥濃度，皮膚是其透皮主要限速因素[6]。

3 討論

芙蓉乳腺寧凝膠膏劑的君藥為木芙蓉葉，木芙蓉葉中蘆丁、異槲皮苷成分的含量低，不能滿足漏槽條件，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，即使透皮時(shí)間為24 h，也并未檢測(cè)到兩者的含量，因此，將含量較高的穿心蓮內(nèi)酯為透皮指標(biāo)。

經(jīng)皮滲透試驗(yàn)為了真實(shí)地模擬人的體內(nèi)環(huán)境，需要保證藥物透皮擴(kuò)散過程處于恒溫狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道[7]，用于治療皮膚病，透皮擴(kuò)散池溫度一般選擇32 ℃，若藥物需透過皮膚進(jìn)入毛細(xì)血管達(dá)到治療作用，則選擇37 ℃。根據(jù)本劑型治療的疾病，確定透皮擴(kuò)散池的溫度為37 ℃。

體外透皮試驗(yàn)中，常用的透皮屏障有鼠皮、人工膜。鼠皮與人的皮膚結(jié)構(gòu)相似，但鼠皮做透皮屏障時(shí)需去除鼠毛和皮下脂肪，物理脫毛對(duì)老鼠皮膚損傷小，但操作麻煩，化學(xué)脫毛對(duì)鼠皮損傷較大，去除皮下脂肪存在操作不易控制等問題，使得實(shí)驗(yàn)平行難以控制。硝酸纖維素膜屬水溶性物質(zhì)，是分子量的原理使有效成分透過，為了模擬人的皮膚結(jié)構(gòu)，在使用前，需用脂溶性的肉豆蔻酸異丙酯浸泡。目前，人工膜作為透皮屏障較為普遍，而且儲(chǔ)藏方便，實(shí)驗(yàn)平行易于控制。因此，本實(shí)驗(yàn)以硝酸纖維素膜做芙蓉乳腺寧凝膠膏劑的體外透皮屏障，篩選其促滲劑。

通過促滲劑優(yōu)選的結(jié)果可知，3%丙二醇一元促滲劑單獨(dú)使用效果比二元促滲劑效果好，可能是偏水溶性的丙二醇比偏脂溶性的氮酮或薄荷腦更容易使脂溶性穿心蓮內(nèi)酯透過凝膠膏劑中的水溶性基質(zhì)[8]。