范書慧，李春花*，柴方紅

1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林市 132109；2.吉林省牧業(yè)信息中心，吉林長(zhǎng)春 130000

犬細(xì)菌性皮膚病是由于細(xì)菌感染發(fā)炎而引起的，又稱膿皮癥，是犬經(jīng)常發(fā)生的皮膚病之一。大多數(shù)病例的病原為葡萄球菌[1]，也可能會(huì)發(fā)現(xiàn)化膿性桿菌、奇異變形桿菌等微生物通過一系列不同的機(jī)制來導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病和死亡[2]。

臨床上治療更多選擇用抗細(xì)菌的西藥，但西藥價(jià)格比較高，并且長(zhǎng)期使用具有明顯耐藥性，抗生素的大量使用是導(dǎo)致抗生素耐藥性主要原因[3]。隨著耐藥菌株的增多和犬的細(xì)菌性皮膚病復(fù)發(fā)率的增高，這讓獸醫(yī)研究者更加努力研究新型抗細(xì)菌藥物。目前傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐以及根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)多種中藥對(duì)細(xì)菌均有不同程度的抗菌作用，并且部分中藥還不能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

因此，本試驗(yàn)選取多種中草藥對(duì)臨床細(xì)菌性皮膚病患犬分離的菌株進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)研究，并對(duì)抑菌效果強(qiáng)的單味中藥進(jìn)行了合理組方，以期為臨床應(yīng)用中藥治療細(xì)菌性皮膚病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院犬舍所提供。

1.1.2 藥品試劑

薄荷，黃芩，防風(fēng)等中藥購(gòu)于吉林市昌邑區(qū)百草堂中藥店。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臨床癥狀患犬患病部位掉毛、掉屑，瘙癢，導(dǎo)致患犬將患病部位撓壞或蹭壞，然后形成結(jié)痂。

1.2.2 病料采集與致病菌的分離鑒定

1.2.2.1 病料采集：在患犬患病部位消毒、剃毛后，刮取病料，將病料裝入消毒過的青霉素瓶中，備用。

1.2.2.2 致病菌的鑒定：在超凈工作臺(tái)上，將病料分別接種到血瓊脂培養(yǎng)基和高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫箱培養(yǎng)24 h，檢查培養(yǎng)情況。根據(jù)菌落大小、形狀、顏色、透明度和粘度等，初步判斷。并挑選若干個(gè)可疑菌落分別進(jìn)行劃線，進(jìn)行純培養(yǎng)、鏡檢，根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及革蘭式染色特性初步判定細(xì)菌種屬，確定細(xì)菌類型。

1.2.3 生化鑒定

使用凝固酶、麥芽糖、甘露醇、V-P試驗(yàn)、透明質(zhì)酸、耐熱核酸酶、馬尿酸鈉、山梨醇、乳糖、葡萄糖、水楊苷、菊糖、棉子糖、蔗糖等分別配制生化鑒定管。將培養(yǎng)皿中的典型菌種在超凈工作臺(tái)上接種至鑒定管中，并在37 ℃下放置24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 菌種保存

對(duì)已經(jīng)鑒定完畢的菌株，無菌條件下挑取單個(gè)菌落接種至1 mL無菌BHI肉湯，振蕩培養(yǎng)16～18 h后，取 新 鮮 菌 液400 μL加 入200 μL滅 菌 的60%甘油混勻，制成20%的甘油菌液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 中藥的篩選

1.2.5.1 中藥提?。簩⒈『?、黃芩、防風(fēng)等19味單味中藥各稱取50 g，分別加水至200～300 mL，大火開鍋后，文火煮30 min。藥汁用紗布過濾，保留濾液。濾渣重復(fù)上述步驟2次后合并濾液，棄去濾渣。再將合并的濾液文火加熱濃縮至50 mL，得到濃縮液1 g/mL。

1.2.5.2 中藥藥敏紙片的制備：取直徑為0.6 cm的滅菌濾紙片在各上述藥液中浸泡40 min，取出備用。

1.2.5.3 菌液制備：首先按照血瓊脂培養(yǎng)基制作說明制備，在其上接種病原菌，37 ℃條件下培養(yǎng)[4]。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，將菌液濃度調(diào)整為5～6×104個(gè)/mL，備用。

1.2.5.4 接種：用微量移液器吸取已經(jīng)制備好的菌液5 μL，將其均勻于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，在已涂布好細(xì)菌的平皿中放置藥敏紙片，每種藥物貼四片，然后將平皿置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈的大小取其平均值，用抑菌圈大小判定抑菌效果[5]。

1.2.5.5 中藥組方抑菌試驗(yàn)：根據(jù)單味中藥抑菌試驗(yàn)的結(jié)果和中醫(yī)辯證理論，確定中藥組方進(jìn)行試驗(yàn)，方法同上，根據(jù)藥敏試驗(yàn)抑菌圈大小判定抑菌效果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 致病菌的分離鑒定結(jié)果

分離出的病原菌在血瓊脂培養(yǎng)基和高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)、鏡檢，視野里有呈菌球形或稍呈橢圓形，排列成葡萄狀的，有呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，革蘭氏染色為陽性。以顯微鏡下微觀結(jié)構(gòu)為判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，疑似葡萄球菌和鏈球菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

對(duì)疑似的葡萄球菌和鏈球菌分別接種于凝固酶、麥芽糖等生化鑒定管，并在37 ℃下放置24 h后觀察結(jié)果，結(jié)果見表1和表2。

表1 病原菌1生化鑒定結(jié)果

表2 病原菌2生化鑒定結(jié)果

由表1和表2結(jié)果可知，病原菌1確認(rèn)為葡萄球菌，病原菌2確認(rèn)為鏈球菌。

2.3 單味中藥體外抑菌結(jié)果

19味單味中藥對(duì)葡萄球菌和鏈球菌分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 19味單味中藥體外抑菌結(jié)果

2.4 中藥組方體外抑菌結(jié)果

根據(jù)表3單味中藥抑菌試驗(yàn)的結(jié)果和中醫(yī)辯證理論，確定以下三組中藥組方進(jìn)行試驗(yàn)。

復(fù)方中藥組一：五倍子、防風(fēng)、黃芩、姜黃、五倍子、百部、小茴香、蒲公英。

復(fù)方中藥組二：防風(fēng)、陳皮、五倍子、姜黃、百部、荊芥、五倍子。

復(fù)方中藥組三：五倍子、防風(fēng)、黃芩、黃柏、小茴香、紫蘇葉。

所選三種中藥組方采用體外抑菌試驗(yàn)，判斷其對(duì)致病性細(xì)菌的抑菌活性，同時(shí)根據(jù)結(jié)果選出最佳組方，結(jié)果見表4。由表4可知，三組中藥組方對(duì)各致病菌都有抑制作用，其中組方一對(duì)兩種致病菌的抑菌效果均高于其他組方。因此根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，綜合各種因素確定組方一為最佳的中藥組方，即五倍子、防風(fēng)、黃芩、姜黃、五倍子、百部、小茴香、蒲公英抑菌效果最好。

表4 中藥組方體外抑菌結(jié)果

3 分析與討論

3.1 本試驗(yàn)所選19味中草藥，皆是文獻(xiàn)記載有抑菌作用的藥物，其中一些已多次在皮膚細(xì)菌病成方中出現(xiàn)。據(jù)高純一報(bào)道，蒲公英葡萄球菌和鏈球菌均有很強(qiáng)的抗菌作用[7]。

3.2 根據(jù)一定的體外抗細(xì)菌方法，篩選出具有明顯抗細(xì)菌作用的中藥，盡管不同中藥對(duì)細(xì)菌抑制作用有特異性，且相同中藥對(duì)各種細(xì)菌的抑制作用也有不一致。但以篩選抗細(xì)菌中藥為前提，還是完成了預(yù)期的目標(biāo)。

3.3 最佳復(fù)方中藥包含五倍子、防風(fēng)、黃芩、姜黃、五倍子、百部、小茴香、蒲公英共8味中藥，幾味藥組合，有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、解毒消腫、燥濕斂瘡之功效，主治風(fēng)熱濕毒所致的風(fēng)疹、皮膚瘙癢、疥癬濕瘡、癰疽腫毒。既符合中醫(yī)理論，又適合制成外用制劑，而該組方的臨床應(yīng)用效果如何，其作用機(jī)理是什么，還有待進(jìn)一步研究。