吳瑩　王銀平　張群　王延?xùn)|

進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平，多種檢測方法并用，切實(shí)發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室檢測在疫情快速準(zhǔn)確處置中的重要作用。方法 在應(yīng)用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法的同時(shí)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR法和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果 此次疑似霍亂疫情被排除，導(dǎo)致患者發(fā)病的致病性微生物最終鑒定為副溶血性弧菌，血清型為O3：K6型，毒力基因?yàn)閠lh+、tdh+、trh-，藥物敏感實(shí)驗(yàn)均為敏感。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)室多重檢測技術(shù)并用，快速準(zhǔn)確高效地為流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)療機(jī)構(gòu)治療提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌;多重檢測技術(shù)并用;快速準(zhǔn)確鑒定;副溶血性弧菌

中圖分類號(hào)：R155.5+5

霍亂是由攝入的食物或水受到霍亂弧菌污染而引起的一種急性腹瀉性傳染病，在《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定中屬于甲類傳染病之一，可導(dǎo)致人類急性感染性腹瀉，主要由O1 群和O139群霍亂弧菌引起。病發(fā)高峰期主要發(fā)生在夏季，傳播途徑主要是糞—口傳播，人感染后嚴(yán)重者能在數(shù)小時(shí)內(nèi)造成腹瀉脫水甚至死亡[1-3]。因此，對(duì)于霍亂的快速應(yīng)對(duì)、精準(zhǔn)處置、有效控制是控制疫情蔓延的必要手段。其中，實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原體的快速準(zhǔn)確鑒定，是疫情處置的關(guān)鍵支撐。

疫情的發(fā)生及經(jīng)過

2019年8月22日早8點(diǎn)，淄博市疾病預(yù)防控制中心接到所轄沂源縣疾病預(yù)防控制中心電話，沂源縣醫(yī)院8月21日晚接診一名水樣便腹瀉病人，經(jīng)霍亂快診試劑檢測，報(bào)告O139群快診弱陽性?？h醫(yī)院立即報(bào)告縣疾控中心，縣疾控中心立即組織專業(yè)人員趕赴現(xiàn)場，進(jìn)行調(diào)查處置，指導(dǎo)縣醫(yī)院按照腸道傳染病進(jìn)行隔離治療并采集病人標(biāo)本，帶回縣疾控進(jìn)行檢驗(yàn)。8月22日早7點(diǎn)，挑取可疑菌落進(jìn)行快診檢驗(yàn)，仍然顯示O1群弱陽性。隨即，沂源縣疾控中心立即報(bào)告淄博市疾控中心，并派專人專車將病人糞便及相應(yīng)增菌液、分離平板上送市疾控中心進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)室檢測復(fù)核

實(shí)驗(yàn)材料

3%NaCl堿性蛋白胨水（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、4 號(hào)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、弧菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）、TCBS瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、霍亂弧菌ctxAB核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌三重核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌診斷血清（日本生科研）、革蘭氏陰性菌藥敏測試板（德國Thermo Fisher）、熒光定量PCR儀（ABI7500）、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）。

標(biāo)本種類及數(shù)量

復(fù)核標(biāo)本3份（患者糞便堿性蛋白胨水增菌液1份、患者糞便分離弧菌顯色平板和4號(hào)瓊脂平板各1個(gè)），患者糞便1份。

檢測方法

霍亂弧菌參照衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》第六版（2013年）[4]進(jìn)行;副溶血性弧菌參照GB4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[5]。

增菌：取病人糞便接種于3%NaCl堿性蛋白胨水中于37℃增菌6～8h。

分離培養(yǎng)：取病人糞便和復(fù)核標(biāo)本（糞便堿胨水增菌液）分別劃線接種于弧菌顯色平板、TCBS瓊脂平板和4號(hào)瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)18～24h。上送的復(fù)核標(biāo)本（患者糞便分離平板）繼續(xù)于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

氧化酶試驗(yàn)：挑取分離平板生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，在1～2min內(nèi)試紙變?yōu)樽仙袨檠趸冈囼?yàn)陽性，不變色判為陰性。陽性的菌落劃線3%NaCl TSA平板進(jìn)行純培養(yǎng)。

霍亂弧菌毒力基因檢測：取復(fù)核標(biāo)本（糞便堿性蛋白胨水增菌液、糞便分離弧菌顯色平板和4號(hào)瓊脂平板上氧化酶陽性的可疑菌落）和患者糞便分別進(jìn)行霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測，具體檢驗(yàn)方法參照試劑盒說明書。結(jié)果判定以樣本檢測Ct值≤34.5為陽性、Ct值≥37.5或無Ct值為陰性、Ct值在34.5～37.5范圍則需對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測。結(jié)果說明見表1。

質(zhì)譜儀鑒定：挑取上送的復(fù)核標(biāo)本（患者糞便劃線分離的平板生長的菌落）進(jìn)行質(zhì)譜儀鑒定。

副溶血性弧菌血清學(xué)鑒定：參照GB4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[5]。

副溶血性弧菌毒力基因檢測：在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測副溶血性弧菌tlh、tdh、trh基因，具體檢驗(yàn)方法參照試劑盒說明書。結(jié)果判定以樣本檢測Ct值≤36為陽性、Ct值≥39或無Ct值為陰性、Ct值在36～39范圍則需對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測。結(jié)果說明見表2。

副溶血性弧菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)：采用微量肉湯稀釋法，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）中推薦的弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)抗生素的選擇原則選取8種抗生素。

結(jié)果

復(fù)核標(biāo)本初步快速鑒定：復(fù)核標(biāo)本進(jìn)行了相應(yīng)的氧化酶實(shí)驗(yàn)、霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測和質(zhì)譜儀鑒定，鑒定結(jié)果見表3。

菌落鑒定：挑取疑似的副溶血性弧菌經(jīng)3%NaCl TSA純化后的菌落，分別進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜儀鑒定和毒力基因檢測，結(jié)果見表4。

血清學(xué)鑒定：對(duì)鑒定確認(rèn)的副溶血性弧菌進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果均為O3：K6型。

耐藥檢測：利用微量肉湯稀釋法，經(jīng)商品化藥敏板鑒定，結(jié)果均為敏感。藥物名稱及濃度見表5。

討論

在此次疑似霍亂疫情中，為了快速確認(rèn)是否是霍亂，我們首先將病人糞便和復(fù)核樣本（糞便初步增菌液、分離平板生長出的菌落）進(jìn)行了霍亂弧菌毒力基因檢測，利用熒光PCR方法特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，來進(jìn)行輔助判定。經(jīng)過3個(gè)小時(shí)左右的實(shí)驗(yàn)，熒光PCR結(jié)果顯示陰性。由于復(fù)核樣本培養(yǎng)時(shí)間短，生長出的菌落形態(tài)不十分典型，為了進(jìn)一步確認(rèn)到底是何種致病性微生物，我們分別挑取可疑菌落進(jìn)行了飛行時(shí)間質(zhì)譜儀鑒定，鑒定結(jié)果均為副溶血性弧菌。副溶血性弧菌耐熱性直接溶血素（tdh）或者耐熱性直接溶血素相關(guān)溶血素（trh）是導(dǎo)致副溶血性弧菌致病的主要毒力因子[6-7]，而且O3：K6血清型是引起副溶血性弧菌感染爆發(fā)的優(yōu)勢血清型[8-9]。我們對(duì)鑒定的10株副溶血性弧菌進(jìn)行純化，又分別進(jìn)行了毒力基因檢測、血清學(xué)檢測和耐藥檢測，毒力基因結(jié)果為tlh陽性、tdh陽性、trh陰性，血清型為O3：K6型，耐藥檢測均為敏感，這也與陳玉貞在山東省副溶血性弧菌生物多態(tài)性和耐藥性研究[10]中相符。

在疫情的處置中，實(shí)驗(yàn)室的快速準(zhǔn)確檢測是重中之重。首先，在對(duì)患者糞便進(jìn)行增菌的同時(shí)，可以直接劃線分離選擇性平板，以此來節(jié)省18～24h。其次，在細(xì)菌鑒定的傳統(tǒng)方法中，同時(shí)運(yùn)用特異性強(qiáng)的實(shí)時(shí)熒光PCR分子生物學(xué)技術(shù)來輔助鑒定，為傳統(tǒng)的生化鑒定指明了方向。再次，在獲得純化后新鮮生長的可疑菌落后，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)菌落進(jìn)行鑒定，既省去了傳統(tǒng)生化鑒定的繁瑣步驟，又節(jié)約了24～48h的傳統(tǒng)生化鑒定時(shí)間，為疫情防控和流行病學(xué)調(diào)查搶得寶貴時(shí)間。在這次的疑似霍亂疫情處置中，檢驗(yàn)人員爭分奪秒、思路明確、有條不紊，在最短的時(shí)間內(nèi)上報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成功地為身在一線的流調(diào)人員流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的準(zhǔn)確用藥提供了可靠的技術(shù)支撐。

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[10]陳玉貞.山東省副溶血性弧菌生物多態(tài)性和耐藥性研究[D].山東：山東大學(xué)， 2016.

基金項(xiàng)目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2017WS562）;課題名稱：副溶血性弧菌的致病性及分子生物學(xué)檢測研究;

作者：吳瑩，女，淄博市疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生檢驗(yàn)中心 主管技師，碩士，主要從事微生物檢驗(yàn)研究。