韓曉鷗 平小紅 依 萍 李延升

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽 110005)

砷(As)是一種自然存在于地殼、廣布于陸地、空氣和水中的類金屬元素[1-3]，可以分為有機(jī)砷和無機(jī)砷兩種類型。不同種類的砷毒性不同，有機(jī)砷化合物如砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)的毒性可以認(rèn)為是無毒的，無機(jī)砷化合物具有一定毒性，其中五價砷化合物比三價砷化合物的毒性低。砷及無機(jī)砷被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(LARC)認(rèn)定為“對人類致癌物質(zhì)”(Ⅰ類)，而有機(jī)砷如DMA、MMA被認(rèn)定為“可能對人類致癌的物質(zhì)”(ⅡB類)，AsB等非在人類體內(nèi)代謝的有機(jī)砷化合物被認(rèn)定為“部分類為對人類有致癌作用”(Ⅲ類)。

短期接觸高濃度無機(jī)砷會導(dǎo)致腹瀉、嘔吐、腹痛、劇痛、麻痹、肌肉抽搐甚至死亡，而長期接觸無機(jī)砷臨床上表現(xiàn)為心肌損傷，而進(jìn)入機(jī)體的無機(jī)砷會分布在肝組織，后被甲基化代謝，而腎臟也會是砷的蓄積部位和毒性作用的主要器官，因?yàn)樯榈倪^量攝入會導(dǎo)致心血管疾病、皮膚色素沉著過度、神經(jīng)中毒、肺部疾病甚至癌癥，如皮膚癌、肺癌、膀胱癌[4,5],且長期接觸即使極少量地接觸無機(jī)砷(2～100 μg/L)也會導(dǎo)致糖尿病、高尿酸血癥、痛風(fēng)等[6-8]。此外，O,Bryant等[9-11]認(rèn)為長期少量地接觸對老年人和成年人的認(rèn)知能力有潛在的影響，甚至可能會導(dǎo)致阿茲海默癥。

食物鏈中無機(jī)砷既可能來源于純天然，也可能來源于殺蟲劑、工業(yè)污染、環(huán)境污染等人類活動。研究表明稻米也是人類攝入無機(jī)砷的主要來源，大米是北方主要的糧食來源，對于稻米中無機(jī)砷污染的管理，國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission)食品污染委員會于2014年一致同意采納將白米中無機(jī)砷的限量定位0.20 mg/kg[9],2015年同意采納將糙米中無機(jī)砷的限量定位0.35 mg/kg[10], 2015年歐盟委員會[11]重新修訂白米、蒸谷米、糙米、米制餅干及蛋糕等米制食品、嬰兒米制食品中的無機(jī)砷最大允許濃度，其限量分別為0.020、0.25、0.25、0.30、0.10 mg/kg、隨后，2016年美國食品藥品管理局(FDA)[12]提議將嬰兒米制食品中無機(jī)砷的限值設(shè)為0.10 mg/kg。而中國的國家標(biāo)準(zhǔn)自2012年以來，對稻谷(稻米)、糙米、大米、嬰幼兒谷類輔助食品中無機(jī)砷的限量始終均為0.20 mg/kg[13,14]。

雖然無機(jī)砷不是禁添加的有害物，但大米是遼寧地區(qū)人們的主要主食，幾乎每家都以米飯為主食，但目前幾乎沒有關(guān)于遼寧地區(qū)大米中無機(jī)砷的風(fēng)險評估報告，為了解遼寧地區(qū)大米的風(fēng)險狀況，本研究建立了遼寧地區(qū)大米流通領(lǐng)域的暴露評估模型，為相關(guān)部門和企業(yè)生產(chǎn)風(fēng)險管理提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀；NexION 300X ICP-MS(電感耦合等離子體質(zhì)譜)；KQ5200DB超聲波清洗器；Milli-Q超純水系統(tǒng)；Sorvall ST 16R臺式冷凍離心機(jī)；LAB DANCER S25漩渦混勻器。

1.2 材料與試劑

無水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、硝酸鉀、乙二胺四乙酸鈉、硝酸，氨水、正己烷、無水乙醇 As(Ⅲ)(GBW08667)、亞砷酸鹽As(Ⅴ)(GBW08666)。

1.3 方法

樣品檢測

1.3.1 樣品前處理

樣品混合均勻用粉碎機(jī)粉碎，稱取樣品1.0 g(準(zhǔn)確至0.001 g)，置50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.15 mol/L的HNO3溶液，放置過夜。置90 ℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，8 000 r/min離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾進(jìn)樣測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)配制

亞砷酸鹽As(Ⅲ):以亞砷酸根計(jì)為124.3 μg/g。用移液槍準(zhǔn)確吸取20 μL標(biāo)準(zhǔn)液，用高純水定容至1.5 mL，濃度為1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液。

砷酸鹽As(Ⅴ)：以砷酸根計(jì)為32.4 μg/g用移液槍準(zhǔn)確吸取86 μL標(biāo)準(zhǔn)液，用高純水定容至1.5 mL，濃度為1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液。

分別吸取亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液(1 000 ng/ml)10、20、40、加入流動相配制成2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，吸取1 ml，5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，用移液槍吸取1 mL純水配成2.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，吸取100 μL 10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，用移液槍吸取900 μL純水配成1 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品使用液，配制成1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，取100 μL進(jìn)樣。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 色譜條件1.3.3.1 色譜柱

陰離子交換色譜柱，Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)

1.3.3.2 儀器條件

液相條件：流動相：稱取 0.895 4 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，3.026 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶解于500 mL高純蒸餾水中，濃度5 mmol/L磷酸氫二鈉，45 mmol/L磷酸二氫鉀，pH為5.92。ICP-MS:條件RF入射功率：1 550 W；載氣為高純氬氣；載氣流速0.65 L/min；補(bǔ)償氣0.15 L/min。泵速0.3 r/s；檢測質(zhì)量數(shù)m/z=75 (As),m/z=35 (Cl)。

1.3.4 計(jì)算公式

HPLC進(jìn)樣分析后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的峰面積為Y值，濃度為X(ng/mL)值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，得出各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=AX+B；樣品的測定結(jié)果按下式計(jì)算：

式中：X為樣品中無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的含量(以As計(jì))/mg/kg;C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到測定溶液中 [A(Ⅲ)或As(Ⅴ)]濃度/μg/L；C0為空白溶液中無機(jī)砷化合物[As(Ⅲ)或As(Ⅴ)]的濃度/μg/L；V為消化液體積/mL；m：為樣品稱樣量/g。

1.3.5 風(fēng)險評估

通過資料表明，大米中確實(shí)有無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的檢出，本文根據(jù)遼寧地區(qū)大米中無機(jī)砷的檢出情況，消防者習(xí)慣調(diào)查，評估消費(fèi)者接觸大米中無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的概率。

調(diào)查是按照遼寧的地理分布進(jìn)行分層，選擇遼寧地區(qū)幾個典型城市進(jìn)行抽樣檢測，其中包括山城，內(nèi)陸城市，沿海城市，沿江城市，抽取不同區(qū)域人流密集的大型商場中的超市，以及老百姓喜歡逛的農(nóng)貿(mào)市場及早市作為調(diào)查地點(diǎn)，按時間、地點(diǎn)、包裝不同采集樣品，測定樣品中無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]含量，建立遼寧地區(qū)大米中無機(jī)砷的危害定量暴露評估模型。建模方法采用概率評估法，即用概率分布來描述模型中的參數(shù)或結(jié)果，以表示該參數(shù)的不確定性和變異性。模型采用Monte Carlo模擬技術(shù)，運(yùn)用風(fēng)險分析軟件@RISK7.5運(yùn)行與分析。各種概率分布都是采用@RISK7.5提供的標(biāo)準(zhǔn)分布函數(shù)來表示，以@RISK軟件的語法書寫，其形式為：分布名稱(參數(shù)1，參數(shù)2，……)。例如三角形分布有三個參數(shù)：最小值、最大值、最可能值，其表達(dá)方式為“RiskTriang (最小值，最可能值，最大值)”[15]。

1.3.6 樣品采集和測定

遼寧地區(qū)大米主要產(chǎn)地為黑龍江省、吉林省、遼寧省的廣大平原地區(qū)，以及少量進(jìn)口大米，其中包括五常大米、珍珠米、黑龍江特產(chǎn)江水大米、稻花香米等，在大型超市中以黑龍江省大米，吉林省大米，以及少量進(jìn)口大米為主，小型農(nóng)貿(mào)及超市以遼寧省本地大米為主，大型超市中大米種類在50種左右，每個城市中選擇30份，小型農(nóng)貿(mào)市場及早市中大米種類為20種左右，每個城市采集20份，因此分別從山城，內(nèi)陸城市，沿海城市，沿江城市，四個城市中采集樣品50份，共采集樣品200份，使用粉碎機(jī)粉碎成大米粉，常溫保存，48 h內(nèi)，對樣品中亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)兩種無機(jī)砷進(jìn)行檢測。結(jié)果見表1。

表1 樣品檢測結(jié)果

1.3.7 建立危害定量暴露評估模型

利用@RISK軟件，根據(jù)以上數(shù)據(jù)提供的全部信息，計(jì)算各種可能的結(jié)果，模擬亞砷酸鹽在遼寧地區(qū)檢出的流行率，模擬為RiskTriang(0.02，0.04，0.07)，模擬砷酸鹽在遼寧地區(qū)檢出的流行率，模擬為RiskTriang (0.02，0.04，0.05)由此呈現(xiàn)風(fēng)險的整個狀況。模型的一次模擬進(jìn)行100次運(yùn)算，每一次運(yùn)算時采用Monte Carlo抽樣方法，從模型各變量的概率分布中抽取1個值， 對這些隨機(jī)抽取的數(shù)字進(jìn)行計(jì)算。評估的結(jié)果以概率分布的形式描述[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化——提取條件的選擇

由于實(shí)驗(yàn)色譜柱選擇的為陰離子色譜柱，且用ICP-MS作為檢測器，因此在提取液選擇上我們一般用酸性物質(zhì)，本次實(shí)驗(yàn)提取液選擇為0.15 mol/L HNO3。在陰性樣品中添加1 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL,通過不同情況下回收率的測定，優(yōu)化檢驗(yàn)方法，前處理方法依照1.3.1，重復(fù)6次，取平均值，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.1.1 提取溶液體積的選擇

在樣品量不變的條件下考察不同溶劑體積(5、10、20、30、40 mL)對同一加標(biāo)樣品中亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷提取效果的影響，試樣結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶劑體積對回收率的影響

從圖1中可見，提取溶劑體積為20、30、40 mL 亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷回收率較高，且無顯著差異?？紤]到增加提取試劑用量會降低方法的靈敏度，且大量酸溶劑的使用不利于環(huán)境保護(hù)，還會增加檢測成本，故選取提取溶液體積為20 mL。

2.1.2 提取溫度

在樣品中添加相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，至恒溫箱中熱浸提，提取溫度分別為(70、80、90、105 ℃)測定回收率，觀察溫度對亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷回收率的影響。 結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對回收率的影響

由圖2中可見，回收率開始增加趨勢明顯，90 ℃時回收率最高，105 ℃時回收率有所下降因此提取溫度設(shè)定為90 ℃。

2.1.3 提取時間

在樣品中添加同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，制成相同濃度的陽性樣品，提取時間分別定為1、2、2.5、3、4 h，檢測不同提取時間對亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷回收率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間回收率的影響

圖3表明，隨著提取時間的增加，As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)回收率開始增加趨勢明顯后基本保持不變，因此選擇2.5 h為提取時間。

2.2 線性范圍和檢出限

按照1.3.1方法配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別吸取亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液(1 000 ng/ml)10、20、40、加入流動相配制成2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，吸取1 mL，5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，用移液槍吸取1 mL純水配成2.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，吸取100 μL 10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，用移液槍吸取900 μL純水配成1 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品使用液，配制成1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL,取100 μL進(jìn)樣。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 目標(biāo)物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

由表2可知，2種無機(jī)砷分離度均大于1表明各個組分之間分離效果好，相關(guān)系數(shù)表明，各個組分峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，可以通過外標(biāo)法定量。

當(dāng)稱樣1.0 g時，亞砷酸鹽As(Ⅲ)的檢出限為0.015 mg/kg定量限為0.040 mg/kg，砷酸鹽As(Ⅴ)的檢出限為0.030 mg/kg定量限為0.080 mg/kg。

2.3 加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，進(jìn)行添加回收率重復(fù)性實(shí)驗(yàn)?？瞻讟悠愤x擇陰性樣品，配制高中低三個濃度回收率，分別取濃度為1 000 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.04、0.1、0.4 mL加入樣品中，冰箱冷藏保存20 h，再按照1.3.1進(jìn)行樣品前處理，重復(fù)做樣品6次，進(jìn)樣量100 μL，檢測樣品重現(xiàn)性。結(jié)果見表3。

由表3可知，亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷回收率在85.0%～97.5%， RSD為0.6%～2.8%；說明該提取方法回收率高，重現(xiàn)性好，可用于大米中無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]檢測。標(biāo)準(zhǔn)分離見譜圖4。

表3 回收率與精密度結(jié)果

圖4 無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖

2.4 實(shí)際樣品分析

對樣品中亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)2種無機(jī)砷進(jìn)行檢測。譜圖見圖5。

圖5 樣品譜圖

樣品檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)論：此方法分離度高，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于大米中無機(jī)砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的檢測。

3 暴露評估模型結(jié)果與分析

大米作為遼寧地區(qū)的主食之一，成年男人每人每日攝入量為1 000 g左右,女人和兒童每人每日攝入量為300～500 g，雖然大米中砷酸鹽、亞砷酸鹽不是禁添加化合物，由于人均攝入量大，消費(fèi)群體龐大，因此此次風(fēng)險評估模型的建立按照砷酸鹽、亞砷酸鹽檢出1種的概率建立，模型分別模擬出遼寧地區(qū)大型商場中的超級市場，小型農(nóng)貿(mào)市場及早市大米中檢出As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]種類大于1的概率。

3.1 遼寧地區(qū)大米中亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出流行率模型建立

根據(jù)城市不同共采集樣品200份，通過檢出種類的統(tǒng)計(jì)，建立在遼寧地區(qū)亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的流行率模型，模擬為RiskTriang (0.02，0.04，0.07)。由模型得出，遼寧省亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的流行率=4.3%。

3.2 建立遼寧地區(qū)大型商場超市中大米的亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出率模型

通過調(diào)查得出遼寧省一般大型商場超市中大米制品的種類為50種左右(包括不同城市同一種產(chǎn)品的各種批次)，根據(jù)亞砷酸鹽As(Ⅲ)的檢出的流行率=0.043，在這50種樣品中有一種樣品亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的概率可以模擬為RiskBinomial(50,0.043) 。

由圖6得遼寧地區(qū)大型商場超市中亞砷酸鹽As(Ⅲ)樣品檢出率大于1的概率大于0小于5%。

圖6 遼寧地區(qū)大型商場超市中有一種大米中亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的概率模型

3.3 建立遼寧地區(qū)小型農(nóng)貿(mào)市場及早市中大米的亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出率模型

通過調(diào)查得出遼寧地區(qū)中，小型農(nóng)貿(mào)市場以及早市中大米的種類為20種左右，根據(jù)大米產(chǎn)品流行率為4.3%，在這20種樣品中有一種樣品亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的概率可以模擬為RiskBinomial(20,0.043) 。

由圖7得遼寧地區(qū)中、小型農(nóng)貿(mào)市場及早市中亞砷酸鹽As(Ⅲ)樣品檢出率大于1的概率大于0小于3%。

圖7 遼寧省中、小型市場有一種大米中亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出的概率模型

3.4 遼寧地區(qū)大米中砷酸鹽As(Ⅴ)檢出率流行率模型建立

根據(jù)檢出種類的統(tǒng)計(jì)，建立在遼寧地區(qū)砷酸鹽As(Ⅴ)樣品檢出的流行率模型，模擬為RiskTriang (0.02，0.04，0.05)。由模型得出遼寧地區(qū)砷酸鹽As(Ⅴ)檢出的流行率=3.67%。

3.5 建立遼寧地區(qū)大型商場超市中大米的砷酸鹽As(Ⅴ)檢出率模型

通過調(diào)查得出遼寧地區(qū)大型商場超市中大米的種類為50種左右(包括不同城市同一種產(chǎn)品的各種批次)，根據(jù)砷酸鹽As(Ⅴ)的流行率=0.037，在這50種樣品中有一種樣品檢出砷酸鹽As(Ⅴ)的概率可以模擬為RiskBinomial(50,0.037)。

由圖8模型得遼寧地區(qū)一般大型商場超市中大米及制品中砷酸鹽As(Ⅴ)檢出種類大于1的概率大于0小于4%。

圖8 遼寧地區(qū)大型超級市場有一種大米中檢出砷酸鹽As(Ⅴ)的概率模型

3.6 建立遼寧地區(qū)小型農(nóng)貿(mào)市場及早市中大米的砷酸鹽As(Ⅴ)檢出率模型

通過調(diào)查得出遼寧省中，小型農(nóng)貿(mào)市場及早市中，大米的種類為20種左右，根據(jù)大米產(chǎn)品流行率為3.67%，在這20種樣品中有一種樣品砷酸鹽As(Ⅴ)檢出的概率可以模擬為RiskBinomial(20,0.037)。

由圖9得遼寧省一般中、小型市場及早市大米中檢出砷酸鹽As(Ⅴ)種類大于1的概率大于0小于2%。

圖9 遼寧省中、小型市場有一種大米中亞砷酸鹽As(Ⅴ)檢出的概率模型

4 結(jié)論

1)通過上述評估模型結(jié)果表明，遼寧地區(qū)一般大型商場超級市場中大米中亞砷酸鹽檢出As(Ⅲ)種類大于1的概率小于5%，遼寧地區(qū)一般中、小型超級市場及早市中大米谷物制品中檢出砷酸鹽As(Ⅲ)種類大于1的概率小于3%，遼寧地區(qū)一般大型商場超市中市場大米產(chǎn)品砷酸鹽As(Ⅴ)檢測種類大于1的概率小于4%，遼寧地區(qū)一般中、小市場及早市中大米產(chǎn)品砷酸鹽As(Ⅴ)檢測種類大于于1的概率小于2%因此，推斷出遼寧地區(qū)大型商場，小型農(nóng)貿(mào)市場大米中亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出1種的平均概率小于4%，砷酸鹽As(Ⅴ)檢出1種的平均概率小于3%。

2)遼寧地區(qū)內(nèi)陸城市，沿江中無機(jī)砷中亞砷酸鹽As(Ⅲ)的檢測率較低，而山城、沿海城市大米產(chǎn)品中亞砷酸鹽As(Ⅲ)的檢出率較高，由于亞砷酸鹽As(Ⅲ)的較高的降解能力，隨著大米產(chǎn)品儲存，運(yùn)輸?shù)臅r間的增加，亞砷酸鹽As(Ⅲ)會轉(zhuǎn)變成其他形態(tài)的砷，因此亞砷酸鹽As(Ⅲ)的檢出率會下降，雖然檢測樣品結(jié)果，各個組分均在限制以內(nèi)，但沿海、山城地區(qū)的亞砷酸鹽As(Ⅲ)檢出率較高，雖然含量值不足以對人們的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，但較高的檢出率應(yīng)該使大眾引起重視。