王昱青 黃平升 郭宏博胡西學(xué)王東亮王 婷何芳菲*

(1 國(guó)家納米科學(xué)中心納米技術(shù)發(fā)展部 北京 100190，2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所 天津 300192)

19F原子體內(nèi)豐度極低(<10-6M)、活體成像時(shí)特異性高、便于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算、成像靈敏度達(dá)到1H原子的83%，近年來(lái)19F核磁成像技術(shù)(19F magnetic resonance imaging,19F-MRI)受到廣泛關(guān)注[1，2]。由于19F-MRI是在19F原子進(jìn)動(dòng)頻率范圍內(nèi)直接對(duì)氟化物進(jìn)行成像，因此成像信號(hào)強(qiáng)度(signal intensity, SI)與化合物中可成像的19F原子豐度密切相關(guān)。

由氟含量最高的超疏水全氟化合物，如全氟化碳(PFC)、全氟聚醚(PFPE)及全氟冠醚(PFCE)等制備的納米乳造影劑，被率先用于19F-MRI成像研究[3-9]。但是其在肝臟和脾臟中快速富集以及長(zhǎng)期滯留，為實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用增加了安全性障礙。為了提高生物安全性，由兩親性氟化分子自組裝構(gòu)建的“智能”納米探針，被應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、pH、氧化還原微環(huán)境、離子和活性氧等生物活性分子/生物信號(hào)檢測(cè)和腫瘤診斷研究[10-15]。但是分子結(jié)構(gòu)中可檢測(cè)的氟含量不足，成為制約自組裝智能納米造影劑體內(nèi)成像效果的瓶頸。另外，一些研究組利用磁性離子順磁弛豫增強(qiáng)效應(yīng)調(diào)控19F弛豫率的方式，將幾個(gè)19F化合物分子與金屬離子配形成螯合物，通過(guò)自組裝方式形成團(tuán)簇等，旨在通過(guò)加快成像速度提高單位時(shí)間內(nèi)采集到的信號(hào)強(qiáng)度[16，17]。但是自組裝團(tuán)簇和金屬螯合物橫向弛豫率過(guò)高，在成像信號(hào)采集之前，已經(jīng)嚴(yán)重衰減，難以獲得理想的成像結(jié)果。針對(duì)這些問(wèn)題，本團(tuán)隊(duì)提出了超親水19F-MRI造影劑的設(shè)計(jì)和制備策略；合成了具有羧酸甜菜堿兩性離子結(jié)構(gòu)的N-(2-甲基丙烯酸乙酯) -N-(3, 3,3-三氟丙基)-N-甲基甘氨酸分子(CBF3)，分子結(jié)構(gòu)式如圖1(左)所示，分子式為C12H19F3NO4+，分子量為298.28；具有分子量小，超親水，代謝速度快等特點(diǎn)[18]。但其縱向弛豫率低，成像速度慢，成像時(shí)間窗較短，制約其作為19F-MRI造影劑的活體成像性能。為此，我們利用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)聚合制備均聚物(PCBF3)，分子結(jié)構(gòu)式如圖1(右)所示，此方式不會(huì)降低分子結(jié)構(gòu)中的氟含量。期望利用PCBF3結(jié)構(gòu)中19F的自旋-自旋耦合作用，顯著提高其縱向弛豫率和橫向弛豫率，有效地提升成像速度和延長(zhǎng)成像時(shí)間窗，改善成像性能。

圖1 氟化物單體和聚合物結(jié)構(gòu)式 (左).單體分子結(jié)構(gòu)；(右).聚合物分子結(jié)構(gòu)

評(píng)價(jià)CBF3或PCBF3的成像性能包括體外和活體成像兩部分。首先，采用多反轉(zhuǎn)恢復(fù)時(shí)間(multi-TI-IR-SE)方法，定量計(jì)算下列成像參數(shù)：縱向弛豫值(R1)、橫向弛豫值(R2)、磁化矢量(M19F)，評(píng)估CBF3和PCBF3的體外成像性能并建立濃度相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線[19，20]。然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CBF3和PCBF3的活體濃度，評(píng)估CBF3或PCBF3的活體成像性能[21-23]。為了能夠綜合評(píng)估造影劑總注射量、代謝速度等因素對(duì)成像性能的影響，我們引入：活體成像利用率(imaging availability in-vivo, IAIV)。該參數(shù)主要衡量19F化合物注入體內(nèi)后，某一時(shí)間點(diǎn)活體成像時(shí)，總注射劑量的實(shí)際可利用比率，比例越高表明該種19F化合物作為造影劑的成像利用率越高、成像時(shí)間窗越長(zhǎng)，有望獲得更好成像性能。

19F-MRI作為一種新興的核磁成像技術(shù)，可對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的外源含氟分子進(jìn)行專(zhuān)一性可視化研究，在疾病精準(zhǔn)診斷、量化示蹤生物活性分子和細(xì)胞等方面具有重要的意義。因此，本研究中設(shè)計(jì)的化合物以及建立的評(píng)價(jià)方法，對(duì)優(yōu)化19F化合物作為造影劑的成像性能，促進(jìn)19F-MRI在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用具有重要作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料

CBF3由中國(guó)醫(yī)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供，分子式為C12H19F3NO4+，PCBF3由RAFT聚合制備。RAFT聚合合成方法：在shlenk反應(yīng)管中依次加入RAFT轉(zhuǎn)移劑苯基-(2-羥乙基)硫代碳酸酯(0.1 mM)、N-(2-氟乙基)-N-(2-甲基丙烯酸乙酯)-N-甲基甘氨酸單體(20 mM)、引發(fā)劑偶氮二異丁腈(0.01 mM)和溶劑二甲基甲酰胺(3 mL)，抽真空/通氬氣3個(gè)循環(huán)后，密閉反應(yīng)管, 在68～72℃的油浴中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入DMF溶解，裝入透析袋中(截留分子量3500 Da)，用去離子水透析72 h，每12 h更換一次。之后，冷凍干燥得到PCBF3聚合物?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整單體和鏈轉(zhuǎn)移劑的摩爾比，進(jìn)而調(diào)控聚合物的聚合度。

1.2 體外37oC條件下19F-MRI成像

采用國(guó)家納米科學(xué)中心小動(dòng)物核磁共振譜像系統(tǒng)(Bruker Biospec 70/20 USR)對(duì)CBF3或PCBF3進(jìn)行成像。將CBF3或PCBF3水溶液置于0.5 mL離心管中，濃度分別為20、401、680和100 mg/mL，利用循環(huán)水浴加熱恒溫至37℃，放入19F/1H雙頻鳥(niǎo)籠線圈中進(jìn)行波譜檢測(cè)和體外成像。采用multi-TI-IR-SE序列測(cè)量樣本的19F-MRI圖像，參數(shù)如下：TE/TR=1.88/5000 ms，TI=100/300/…/1100 ms, FA=90°, FOV=50×50mm, MTX=100×100, slice thickness=4mm, slice number=1, NEX=10。

體外成像參數(shù)R1、R2、M19F值的計(jì)算公式如下：

SI=M19F×(1-2×e(-TI×R1)+e(-TR×R1))×e(-TE×R2)

(1)

SI：采集的CBF3或PCBF3的信號(hào)強(qiáng)度；TI：反轉(zhuǎn)時(shí)間；TR：重復(fù)時(shí)間；TE：回波時(shí)間。利用Levenberg-Marquardt算法進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算37oC時(shí)所有濃度CBF3或PCBF3的R1、R2、M19F值及它們與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系r1、r2、m19F值。

1.3 活體成像

Balb/c小鼠(雌，6～8周)尾靜脈注射200 μL濃度100 mg/mL的CBF3或PCBF3，2小時(shí)后水合氯醛腹腔麻醉后，將小鼠放入19F/1H雙頻鳥(niǎo)籠線圈中，通氧氣和循環(huán)水維持小鼠生理狀態(tài)，檢測(cè)CBF3或PCBF3在活體水平上的波譜。然后，將成像的工作頻率與體外測(cè)量工作頻率調(diào)節(jié)一致，進(jìn)行活體19F-MRI圖像采集，采用IR-SE序列，參數(shù)如下：TE/TR=1.88/5000 ms, TI=0ms, FA=90°, FOV=50×50mm, MTX=100×100, slice thickness=4mm, slice number=5, NEX=10。相應(yīng)的，測(cè)量1H-MRI圖像作為背景圖，采用TSE序列，參數(shù)如下：TE=4.64ms, TR=300ms, FA=90°, FOV=50×50 mm, MTX=256×256, slice thickness=1mm, slice number=20, ETL=2。

1.4 活體成像速度計(jì)算

活體成像速度與MTX中的相位編碼數(shù)量和TR參數(shù)相關(guān)，當(dāng)TI=0、MTX值固定時(shí)，活體成像速度僅由TR決定。根據(jù)公式(1)，在保持T1成分(1-e(-TR×R1))不變的情況下，根據(jù)R1值可以計(jì)算出對(duì)應(yīng)的TR值。

1.5 活體濃度和活體成像利用率定量計(jì)算

定量計(jì)算CBF3或PCBF3活體濃度包括兩個(gè)步驟，第一步：通過(guò)體外成像建立CBF3或PCBF3的SI與濃度對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；第二步：將活體成像采集的SI代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CBF3或PCBF3活體濃度分布[24-26]。選取活體成像時(shí)背景噪聲的平均SI為閾值，計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度閾值。然后將高于閾值的濃度分布圖疊加到小鼠的1H-MRI圖像上觀察濃度分布?；铙w成像利用率IAIV計(jì)算公式如下：

(2)

C：體素i的濃度；V：體素i的體積；n：高于濃度閾值的體素個(gè)數(shù)；M：總注射量。然后計(jì)算活體成像時(shí)CBF3或PCBF3工作頻率的譜峰信噪比與體外成像時(shí)同濃度同體積CBF3或PCBF3的譜峰信噪比的比值(RIA)，將波譜結(jié)果與成像結(jié)果進(jìn)行比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 R1值

37℃時(shí)PCBF3的R1值比CBF3的R1值顯著升高(p=3.363*10-15< 0.001), R1值平均升高了約125.9%。如圖2所示，PCBF3濃度與R1之間的相互關(guān)系r1=0.00003(p=0.0577>0.05)，表明PCBF3的R1值與濃度之間無(wú)顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)PCBF3的R1值為一個(gè)常數(shù)1.83 s-1；CBF3濃度與R1之間的相互關(guān)系r1=0.000015(p=0.0749>0.05)，表明CBF3的R1值與濃度之間無(wú)顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)CBF3的R1值為一個(gè)常數(shù)0.81 s-1。

圖2 CBF3和PCBF3的R1與濃度的線性關(guān)系r1

2.2 R2值

37℃時(shí)PCBF3的R2值比CBF3的R2值顯著升高(p=4.192*10-19<0.001), R2值平均升高了約1126.9%。如圖3所示，PCBF3濃度與R2之間的相互關(guān)系r2=0.00001(p=0.1393>0.05)，這表明R2值與濃度之間無(wú)顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)PCBF3的R2值為一個(gè)常數(shù)20.49 s-1；CBF3濃度與R2之間的相互關(guān)系r2=0.000001(p=0.1423>0.05)，這表明R2值與濃度之間無(wú)顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)CBF3的R2值為一個(gè)常數(shù)1.67 s-1。

圖3 CBF3和PCBF3的R2與濃度的線性關(guān)系r2

2.3 M19F值

37℃時(shí)PCBF3的M19F值比CBF3的M19F值顯著升高(p=0.005<0.01)，M19F值平均升高了約32.3%。如圖4所示，PCBF3濃度與M19F之間的相互關(guān)系m19F=0.316 (p=4.18*10-6<0.001)，這表明M19F值與濃度之間存在顯著的線性關(guān)系；CBF3濃度與M19F之間的相互關(guān)系m19F=0.241 (p=4.1*10-6<0.001)，這表明M19F值與濃度之間存在顯著的線性關(guān)系。根據(jù)公式(1)，當(dāng)TI時(shí)間固定后，CBF3或PCBF3的SI僅與M19F呈線性關(guān)系。

圖4 CBF3和PCBF3的M19F與濃度的線性關(guān)系m19F

2.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將公式(1)中TI/TE/TR分別設(shè)定為0/1.88/5000 ms時(shí)，根據(jù)上述參數(shù)計(jì)算結(jié)果，PCBF3的M19F值與SI之間的線性關(guān)系為：SI= 0.9621*M19F，濃度與M19F值的線性關(guān)系為：C= 3.169*M19F-2.701(R2=0.9995)；CBF3的M19F值與SI之間的線性關(guān)系為：SI=0.9795*M19F，濃度與M19F值的線性關(guān)系為：C= 4.146*M19F-1.961。將PCBF3和CBF3各自的兩組線性關(guān)系結(jié)合，PCBF3的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：C= 3.294*SI-2.701(R2=0.9994)，即CBF3的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：C= 4.233*SI-1.961。

2.5 活體成像速度

CBF3活體成像時(shí)參數(shù)如下：R1=0.81s-1, NEX=10, TI=0, TR=5000 ms, acquired time=1140 s，CBF3活體成像時(shí)間為1140s。根據(jù)公式(1)如果PCBF3和CBF3的T1成分(1-e(-TR×R1))相同，則PCBF3活體成像時(shí)參數(shù)如下：R1=1.83 s-1, NEX=10, TI=0, TR=2213 ms, acquired time=505s, 即PCBF3活體成像時(shí)間為505s。

2.6 活體濃度及活體成像利用率

將活體成像時(shí)采集到的CBF3或PCBF3的SI分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，獲得活體濃度分布圖，結(jié)果如圖5所示。體外、活體19F-MRS結(jié)果如圖5右側(cè)所示。圖5a為CBF3的注射后2小時(shí)活體濃度分布圖；圖5b為PCBF3的注射后2小時(shí)活體濃度分布圖。CBF3或PCBF3的活體成像利用率IAIV值和波譜分析結(jié)果RIA值，結(jié)果如表1所示。如圖5a所示，尾靜脈注射后2小時(shí)后其他臟器組織廓清，CBF3全部匯聚于膀胱。表1顯示，CBF3注射后2小時(shí)的IAIV為8.3%，波譜分析計(jì)算出的RIA為8.1%，結(jié)果基本一致。如圖5b所示，PCBF3注射后2小時(shí)廣泛地分布在血管、各臟器、肌肉等區(qū)域。表1顯示，PCBF3注射后2小時(shí)的IAIV為84.7%，波譜分析計(jì)算出的RIA為84.3%，兩者基本一致。

表1 CBF3和PCBF3的IAIV和RIA

圖5 CBF3和PCBF3的活體濃度分布圖和波譜圖左側(cè)圖a表示CBF3注射后2小時(shí)活體濃度分布圖；左側(cè)圖b表示PCBF3注射后2小時(shí)活體濃度分布圖；右側(cè)上兩幅圖分別表示CBF3的體外和體內(nèi)波譜圖；右側(cè)下兩幅圖分別表示PCBF3的的體外和體內(nèi)波譜圖。

3 討論

本研究利用multi-TI-IR-SE方法在體外37oC溫度條件下分別計(jì)算了CBF3和PCBF3的R1、R2、M19F值，并建立了CBF3和PCBF3的SI與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算CBF3和PCBF3的活體成像利用率。

計(jì)算結(jié)果表明，PCBF3的R1、R2、M19F值均比CBF3的明顯升高。PCBF3的R1值升高是因?yàn)槠浞肿咏Y(jié)構(gòu)由CBF3重復(fù)單元通過(guò)碳碳鍵鏈接形成，分子量大，其進(jìn)動(dòng)頻率與周?chē)Ц竦倪M(jìn)動(dòng)頻率更接近，高能級(jí)19F原子更容易向周?chē)Ц襻尫拍芰?，縱向弛豫時(shí)間變短[27]。PCBF3的R2值升高是因?yàn)?9F原子間自旋-自旋耦合作用更強(qiáng)，19F原子散相速度更快，橫向弛豫時(shí)間更短[28]。雖然PCBF3的氟含量與CBF3相同，但CBF3分子量小，37℃時(shí)在主磁場(chǎng)中處于低能級(jí)的19F原子更容易躍遷至高能級(jí)。相比之下，PCBF3分子量大，37℃時(shí)在主磁場(chǎng)中處于低能級(jí)的19F原子不易躍遷至高能級(jí)?？偟谋憩F(xiàn)是PCBF3中低能級(jí)與高能級(jí)19F原子數(shù)量比值，相比CBF3增加，因而PCBF3的M19F更高[16-19]。

從信號(hào)強(qiáng)度貢獻(xiàn)度來(lái)看，PCBF3或CBF3的SI均由T1、T2和M19F 3個(gè)成分組成。與同濃度的CBF3相比，R1值升高使得PCBF3的SI的T1成分增強(qiáng)了1.76%，R2值升高使得PCBF3的SI的T2成分減弱了3.48%，M19F值升高使得PCBF3的SI的M19F成分增強(qiáng)了約32.3%。因此，同濃度的PCBF3與CBF3之間的SI差別主要來(lái)源于M19F值。此外，如果和CBF3保持相同的T1成分信號(hào)強(qiáng)度貢獻(xiàn)度，由于PCBF3的R1值升高活體成像速度可以提高約2.26倍。

從濃度依賴(lài)性來(lái)看，無(wú)論是PCBF3還是CBF3，僅M19F值具有濃度依賴(lài)性。37℃時(shí)，PCBF3或CBF3的R1值在20 ～ 100 mg/mL濃度范圍內(nèi)均為常數(shù)，其原因是在該溫度下不同濃度兩者的分子運(yùn)動(dòng)自由度差異很小[29]。PCBF3或CBF3的R2值在20 ～ 100 mg/mL濃度范圍內(nèi)均為常數(shù)，這是因?yàn)椴煌瑵舛萈CBF3或CBF3的溶解性很好，沒(méi)有分子間自旋耦合現(xiàn)象發(fā)生[29]。PCBF3和CBF3的M19F值與濃度均存在顯著線性關(guān)系，這是因?yàn)镸19F值是用來(lái)定量描述某一溫度下處于主磁場(chǎng)中單位體積溶液里低能級(jí)比高能級(jí)多出來(lái)的19F原子總數(shù)，即成像可利用的19F原子密度，因而化合物濃度越高則19F原子密度越高，即M19F值越高[2]。

從活體成像來(lái)看，如圖5a所示，活體濃度分布圖表明CBF3在注射后2小時(shí)后，全部匯聚于膀胱，在其它組織很難檢測(cè)到信號(hào)。圖5中活體19F-MRS譜圖顯示，工作頻率譜峰的信噪比很低，與單體的生物分布結(jié)果一致。表1結(jié)果顯示，CBF3的活體成像利用率IAIV僅8%左右，表1波譜計(jì)算結(jié)果RIA為8.1%，與成像方法計(jì)算的結(jié)果基本吻合。綜合表明CBF3在體內(nèi)代謝速度很快，并未與體內(nèi)蛋白或細(xì)胞等發(fā)生結(jié)合；該結(jié)果可歸因于CBF3的分子結(jié)構(gòu)，其分子量?jī)H298，親水性好，代謝速度非常快，因此各臟器的成像時(shí)間窗很短。如圖5b所示，活體濃度分布圖表明PCBF3在注射后2小時(shí)主要分布在腹主動(dòng)脈、各臟器、肌肉等區(qū)域。PCBF3濃度的生物分布結(jié)果表明其較為穩(wěn)定，代謝過(guò)程較長(zhǎng)(代謝動(dòng)力學(xué)分析和活體成像結(jié)果顯示48小時(shí)后基本代謝完成)。表1結(jié)果顯示PCBF3的活體成像利用率達(dá)到84%左右，波譜計(jì)算結(jié)果RIA與成像方法計(jì)算的結(jié)果基本吻合。從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，PCBF3的活性官能團(tuán)得到保護(hù)，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，分子量較大，代謝速度降低，成像時(shí)間窗更長(zhǎng)。

綜上所述，PCBF3的活體成像性能更好，但是也存在進(jìn)一步優(yōu)化的地方。比如19F-MRS譜圖顯示PCBF3的譜峰半高寬較寬，這將導(dǎo)致其19F原子在工作頻率內(nèi)吸收射頻能量效率不一致，成像性能比理論水平有所降低；此外，PCBF3的R2值增高會(huì)帶來(lái)成像信號(hào)的T2成分衰減。因此，下一步研究將重點(diǎn)探討聚合度對(duì)PCBF3成像效能的影響，以及通過(guò)序列優(yōu)化消除T2成分衰減的問(wèn)題。

4 結(jié)論

本研究采用19F-MRS/MRI相結(jié)合的方法，定量分析了CBF3和PCBF3的成像性能。相比之下，PCBF3的活體成像利用率更高，可以延長(zhǎng)成像時(shí)間窗、提升成像速度，成像性能更好；作為19F-MRI造影劑在活體核磁成像方面更具潛力。