隋文婕 張晶晶 湯慶麗 陳鑫 唐于榮

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種由血糖升高引起的視網(wǎng)膜微血管損傷類疾病，屬于糖尿病并發(fā)癥。近年來，DR發(fā)病率呈較高水平且逐年上升[1]。DR患者主要癥狀有視網(wǎng)膜前出血、視網(wǎng)膜脫離、不同程度視力障礙等，若病情不能得到及時控制，DR可能發(fā)展為有新生血管形成的增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。PDR可加劇患者視網(wǎng)膜出血，引發(fā)視網(wǎng)膜脫離等其它增生型病變，嚴(yán)重影響患者健康[2]。有研究表明，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是影響PDR進(jìn)展中新生血管形成關(guān)鍵因素[3]。Shen等在宮頸癌中研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA 漿細(xì)胞瘤變異易位基因1(long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation，lncRNA PVT1)可通過調(diào)節(jié)EMT，影響癌細(xì)胞增殖[4]。有研究表明，微小RNA-26b(micro RNA-26b，miR-26b)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)，可參與調(diào)控替莫唑胺耐藥介導(dǎo)的EMT過程[5]。由于lncRNA PVT1和miR-26b在PDR中表達(dá)水平及意義尚不清楚，本研究通過檢測PDR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1和miR-26b表達(dá)水平，分析與相關(guān)臨床指標(biāo)相關(guān)性，探討二者與PDR進(jìn)展關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究PDR相關(guān)影響機(jī)制和臨床診治提供一定幫助。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年3月至2019年3月本院收治的單眼發(fā)病的PDR患者58例為研究對象(PDR組)。其中男性31例，女性27例，年齡41～75歲，平均年齡(53.29±16.31)歲。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會眼科學(xué)分會眼底病學(xué)組診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，將入組PDR患者分為：Ⅴ期33只眼，Ⅵ期25只眼。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為2型糖尿病引起的PDR病變；②需行患眼玻璃體切除術(shù)；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他眼部手術(shù)史；②合并患有高血壓；③合并患有惡性腫瘤及其他器官重大疾病者。另選取同期因特發(fā)性黃斑裂孔行玻璃體切除術(shù)患者35例作為對照組。其中男性19例，女性16例，年齡40～73歲，平均年齡(52.87±15.64)歲。對照組均為單眼發(fā)病，排除伴有惡性腫瘤、高度近視及其他眼部疾病、免疫系統(tǒng)及感染性疾病患者。所有入組者對本研究知情并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

二、主要儀器和試劑

實時熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：7900HT，美國ABI公司)、全自動生化分析儀(型號：BS-220，南京貝登醫(yī)療股份有限公司)、RNA提取試劑盒(貨號：9767，日本Takara公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR047A，日本Takara公司)、qRT-PCR試劑盒(貨號：RR820A，日本Takara公司)。

三、方法

1.樣本采集：所有受試者于入組時清晨(7:00～9:00)空腹采集外周靜脈血5 ml，經(jīng)離心后分離上清液，用于常規(guī)指標(biāo)檢測。

于玻璃體切除術(shù)時收集所有受試者玻璃體和膜組織。于灌注前用玻璃體切割頭收集玻璃體組織0.6 ml，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。術(shù)中收集PDR患眼視網(wǎng)膜前增生膜和對照組內(nèi)界膜組織，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.玻璃體和膜組織中各因子表達(dá)水平檢測：采用qRT-PCR法檢測玻璃體和膜組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表達(dá)水平。使用RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA后，用于qRT-PCR實驗。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：ROX 0.4 μl ，SYBR?rimix Ex TaqTM10 μl ，上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl，cDNA 2 μl，dH2O 6.0 μl。具體反應(yīng)步驟如下：95 ℃、33 s，1循環(huán)；95 ℃、5 s；62 ℃、38 s，40循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，用2-△△CT法計算lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR所用引物見表1所示，lncRNA PVT1、VEGF以β-actin為內(nèi)參基因，miR-26b以U6為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR引物序列

3.血清常規(guī)指標(biāo)檢測：使用全自動生化分析儀檢測所有受試者血清糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組一般資料比較

PDR組和對照組患者年齡、性別比例、體質(zhì)指數(shù)(BMI)值、血清LDL-C水平、TC水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PDR組血清FBG、HbA1c水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表1，2。

表2 兩組一般資料比較

二、兩組患眼玻璃體中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

PDR組患眼玻璃體中l(wèi)ncRNA PVT1、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，miR-26b表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清FBG、HDL-C、LDL-C、TG、TC、HbAlc比較

三、兩組患眼膜組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

PDR組患眼膜組織中l(wèi)ncRNA PVT1、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，miR-26b表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患眼玻璃體中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b表達(dá)水平比較

四、PDR組患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b表達(dá)水平相關(guān)性

PDR組患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平均與miR-26b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.424，P=0.001；r=-0.449，P=0.000)。見圖1，2。

五、DR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)相關(guān)性

PDR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平均與患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈正相關(guān)，與患者血清HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。PDR患眼玻璃體和增生膜中miR-26b表達(dá)水平均與患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈負(fù)相關(guān)，與患者血清HDL-C呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患眼增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-26b表達(dá)水平比較

表6 PDR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRN APVT1、miR-26b表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)相關(guān)性

討 論

PDR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但視網(wǎng)膜新生血管生成是引發(fā)PDR關(guān)鍵因素。探尋與視網(wǎng)膜新生血管生成相關(guān)因子對明確PDR發(fā)病機(jī)理、臨床有效控制病情進(jìn)展有重要意義。

lncRNA是一種長度大于200 nt的非編碼RNA，可通過轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)修飾等方式參與人體組織修復(fù)、疾病調(diào)控等過程。有研究表明，lncRNA可參與DR、脈絡(luò)膜新生血管、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變等眼部增生性疾病進(jìn)展[7]。lncRNA PVT1位于人類染色體8q24，可通過參與2、22號染色體間復(fù)發(fā)性易位，參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控[8]。本研究結(jié)果顯示，PDR組患眼玻璃體和膜組織中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平明顯高于對照組，提示lncRNA PVT1表達(dá)水平升高可能與PDR發(fā)生有關(guān)。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，為膠質(zhì)瘤抗血管生成治療提供了靶點[9]。提示lncRNA PVT1可能通過影響視網(wǎng)膜新生血管生成，參與調(diào)控PDR發(fā)生發(fā)展。有研究證實，lncRNA PVT1過表達(dá)可影響VEGF表達(dá)水平升高，促進(jìn)血管生成與胃癌微血管密度增大[10]。VEGF是EMT重要調(diào)節(jié)因子[11]，Kashiwagi等研究報道，EMT與腫瘤血管重構(gòu)密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，VEGF mRNA在PDR組患眼玻璃體和增生膜中表達(dá)水平明顯升高，且與lncRNA PVT1表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示lncRNA PVT1可能通過調(diào)控VEGF介導(dǎo)的EMT進(jìn)程，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成，參與PDR進(jìn)展。

miRNA是一種具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，能參與疾病發(fā)生發(fā)展。研究報道，miRNA與PDR發(fā)生及患病嚴(yán)重程度有關(guān)，具有成為PDR早期檢測生物學(xué)標(biāo)志物的潛力[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDR組患眼玻璃體和膜組織中miR-26b表達(dá)水平明顯低于對照組，提示miR-26b水平降低可能對PDR發(fā)生有一定作用。miR-26b屬于miR-26家族，與血管平滑肌細(xì)胞分化、血管生成及心血管修復(fù)密切相關(guān)[14]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-26b可抑制癌細(xì)胞成管能力，促使腫瘤微血管密度下降[15]。提示miR-26b對PDR抑制作用可能與視網(wǎng)膜新生血管生成有關(guān)。有研究報道，miR-26b可通過調(diào)節(jié)VEGF抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移[16]。研究證實，VEGF與EMT調(diào)控有關(guān)[11]，影響血管生成[17]。Dong等研究表明，人晶狀體上皮細(xì)胞中miR-26b下調(diào)表達(dá)促進(jìn)EMT進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果顯示，miR-26b與VEGF mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示本研究中miR-26b下調(diào)可能通過影響VEGF水平和EMT，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管生成，促進(jìn)PDR發(fā)生發(fā)展。

Wang等研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1在黑色素瘤組織中明顯上調(diào)，可通過與miR-26b結(jié)合，降低miR-26b抑癌作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[19]。本研究結(jié)果顯示，PDR組患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平均與miR-26b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA PVT1與miR-26b間可能存在相互作用，共同影響PDR進(jìn)展。

Aryan等研究報道，血清HDL-C水平變化與糖尿病型微血管病變嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為糖尿病微血管并發(fā)癥特異性預(yù)測因子[20]。Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，PDR組患者空腹血漿血糖、HbA1c水平明顯高于單純糖尿病組和非增生型DR組[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)水平均與患者血清FBG、HbA1c呈正相關(guān)，與患者血清HDL-C呈負(fù)相關(guān)。PDR患眼玻璃體和增生膜中miR-26b表達(dá)水平均與患者血清FBG、HbA1c呈負(fù)相關(guān)，與患者血清HDL-C呈正相關(guān)。進(jìn)一步提示lncRNA PVT1、miR-26b表達(dá)水平異?？赡軐DR發(fā)生發(fā)展有重要影響。

綜上所述，PDR患眼玻璃體和增生膜中l(wèi)ncRNA PVT1水平顯著升高、miR-26b水平顯著降低，與患者血清FBG、HbA1c及HDL-C水平變化有關(guān)，二者之間可能存在相互作用，共同影響PDR進(jìn)展。但由于本研究樣本量較少，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實驗驗證。