戴斌 陳競緯 張國興 吳瑛瀅

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 江蘇，蘇州 215000 2.蘇州大學(xué)

炎性細(xì)胞因子主要與機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)有關(guān)，已被證實是多種心血管疾病的起始、進(jìn)展和臨床意義的關(guān)鍵因素。促炎細(xì)胞因子能夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管活性物質(zhì)釋放、引起內(nèi)皮功能紊亂[1]，同時還能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化，參與疾病進(jìn)程[2]，可見炎性細(xì)胞因子與高血壓病的發(fā)生發(fā)展和其靶細(xì)胞損害均有關(guān)。抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，是否能改善高血壓病患者的癥狀和預(yù)后，是目前研究的方向。培補(bǔ)二天膏是我院陳競緯主任醫(yī)師結(jié)合葉天士、秦伯未膏方用藥經(jīng)驗及自身臨證經(jīng)驗所創(chuàng)，主要針對老年高血壓病患者。方以天麻鉤藤飲及六味地黃丸為基礎(chǔ)，選取山萸肉、菟絲子、天麻，牛膝、白術(shù)、砂仁、酸棗仁等藥物，其中重用山萸肉、菟絲子、天麻為君，起到補(bǔ)肝腎脾、化痰活血的作用，在臨床應(yīng)用過程中控制血壓效果頗佳[3]。本研究擬進(jìn)一步觀察其對自發(fā)性高血壓大鼠 （spontaneously hypertensive rats，SHR）血壓、炎性細(xì)胞因子和心臟重構(gòu)的影響，探究其降壓及改善心臟重構(gòu)的可能機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SHR大鼠50只，12月齡，體重（382±29）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 ［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （京）2016-0006］；清潔級雄性Wister kyoto（WKY）大鼠9只，12月齡，體重（357±32）g，來自日本奈良醫(yī)科大學(xué)第二生理學(xué)科。實驗在蘇州大學(xué)實驗動物中心［實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0045］完成。

1.2 藥物與試劑 培補(bǔ)二天膏主要成分：天麻150g、川牛膝150g、白術(shù)300g、砂仁50g、五味子150g、酸棗仁150g、山萸肉300g、菟絲子100g、太子參150g、綠萼梅100g、藏紅花1g、三七片150g、姜半夏150g、澤瀉150g、黃連60g、麥冬150g、焦山楂120g、陳皮100g、東阿阿膠250g、龜甲膠100g，以上藥物均購于蘇州春暉堂，膏方于實驗前1周由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院中藥房制備完成。厄貝沙坦片（商品名：安博維，規(guī)格：150mg/片）購于杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司 （批號：8A157）；大鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、大鼠IL-2 ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒均購于聯(lián)科生物（批號：EK301B/3、EK302/2、EK306/3、EK382HS）。

1.3 實驗儀器 XH100尾動脈血壓測定儀購于北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；MedLab-U/4C501數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)購于上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司；冷凍臺式離心機(jī)為美國Thermo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購于南京寶城生物技術(shù)有限公司；RM2016病理切片機(jī)購于上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡和Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購于日本尼康公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥 將SHR編號后測量動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）作為實驗前基礎(chǔ)血壓，剔除其中SBP＜140mmHg的SHR后，將余下SHR分為5組：陰性對照組，膏方低、中、高劑量組，厄貝沙坦組；另將同月齡WKY大鼠作為WKY組。實驗開始第2周陰性對照組1只大鼠突發(fā)中風(fēng)偏癱，遂剔除；最終各組數(shù)量為WKY組9只，膏方低、中、高劑量組各組9只，厄貝沙坦組10只，陰性對照組7只。按人-大鼠體表面積比值折算大鼠的等效劑量，臨床等效劑量=臨床用藥劑量×等效劑量系數(shù)，70kg成人與400g大鼠按體表面積折算的等效劑量系數(shù)為0.027，低、中、高劑量組為臨床等效劑量組的濃度的0.5、1、3倍。即膏方中劑量組大鼠每kg體重用藥劑量=人 （70kg）用藥劑量×0.027/0.4。

計算得出，膏方低、中、高劑量組大鼠給藥量分別為0.58g/（kg·d）、1.15g/（kg·d）、3.46g/（kg·d）， 厄貝沙坦組按上述公式計算得出給藥量為10.13mg/（kg·d），以溫蒸餾水稀釋成混懸液，每只灌胃總量約2mL；陰性對照組及WKY組每日以溫蒸餾水10mL/（kg·d），每日每只灌胃總量約2mL。

1.4.2 SBP測定 利用無創(chuàng)尾動脈血壓測定儀測定大鼠尾動脈SBP，所有大鼠分別于給藥前、給藥后每周的周日上午10∶00（或服藥后0.5～1h）測定血壓，每次血壓重復(fù)測定3次，取平均值作為大鼠的尾動脈SBP。

1.4.3 ELISA檢測血清炎性細(xì)胞因子水平 末次給藥后，所有大鼠禁食12h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，于工作臺上剪開腹腔，腹主動脈取血約10mL，4℃靜置30min分層，4℃下3 000r/min離心15min，分離血清，置56℃水浴滅活30min，分裝后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?以ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 心臟重量指數(shù)（heart mass index，HMI）檢測各組大鼠取血后迅速分離心臟，在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中漂洗，除去血液，去除大血管殘根和結(jié)締組織，濾紙吸干后稱重，HMI=心臟重量/體重。

1.4.5 心肌病理形態(tài)觀察 稱重完成后的大鼠心臟于4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋，于左心室部位行連續(xù)3μm切片，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞病理變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，WKY組與陰性對照組SHR比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，SHR各組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實驗前后SBP比較 給藥前，各給藥組SHR與陰性對照組間SBP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），WKY組大鼠SBP明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，實驗第1周后，膏方高劑量組和厄貝沙坦組SBP明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；實驗第2周后，膏方高劑量組及厄貝沙坦組SBP仍然低于陰性對照組（P＜0.01，P＜0.05）；實驗第3周后，膏方高劑量組SHR血壓出現(xiàn)升高，且與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而厄貝沙坦組SBP仍低于陰性對照組（P＜0.01）；實驗第4周后，膏方中、高劑量組及厄貝沙坦組明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。見表1。實驗第1周，膏方低劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），中、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗第2周，膏方各劑量組與厄貝沙坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗第3周，膏方低、中劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗第4周，膏方低劑量組SBP明顯高于厄貝沙坦組（P＜0.05），中、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠實驗前后SBP比較（mmHg）Tab.1Comparison of SBP among groups before and after the experiment（mmHg）

表2 各組大鼠血清IL-1β水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum IL-1β levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2 各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平比較

2.2.1 各組大鼠各組大鼠血清IL-1β水平比較 實驗4周后，陰性對照組血清IL-1β水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，各給藥組SHR血清IL-1β水平均降低（P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組血清IL-1β水平均升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

2.2.2 各組大鼠血清IL-2水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清IL-2水平高于WKY組（P＜0.05）。與陰性對照組比較，膏方各劑量組和厄貝沙坦組IL-2水平明顯降低（P＜0.01）。與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組IL-2水平升高，其中低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而中、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3。

2.2.3 各組大鼠血清IL-6水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清IL-6水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方各劑量組和厄貝沙坦組SHR血清IL-6水平降低（P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組IL-6水平均升高，其中低、中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表4。

表3 各組大鼠血清IL-2水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum IL-2 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表4 各組大鼠血清IL-6水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.4 Comparison of serum IL-6 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2.4 各組大鼠血清TNF-α水平比較 實驗4周后，陰性對照組SHR血清TNF-α水平明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方低、中劑量組TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而膏方高劑量組及厄貝沙坦組TNF-α水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，膏方各劑量組TNF-α水平都明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。 見表5。

2.3 各組大鼠心臟重量、體重及HMI比較 實驗4周后，各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。陰性對照組心臟重量及HMI均明顯高于WKY組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，膏方高劑量組及厄貝沙坦組心臟重量及HMI降低（P＜0.05）。與厄貝沙坦組比較，膏方低劑量組HMI升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他各劑量組心臟重量和HMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表6。

2.4 各組大鼠心肌病理形態(tài)觀察 光鏡下觀察可見陰性對照組心肌細(xì)胞肥大，核增大，排列紊亂，部分心肌細(xì)胞壞死；間質(zhì)纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤，部分脂肪變性。膏方低劑量組心肌細(xì)胞肥大，個別細(xì)胞核增大，排列紊亂；大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生；中劑量組心肌細(xì)胞中度肥大，排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤較陰性對照組及低劑量組明顯減少，少量纖維組織增生；高劑量組心肌細(xì)胞肥大減輕，排列較整齊；間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯少于陰性對照組，可見少量纖維增生。厄貝沙坦組心肌細(xì)胞輕度肥大，細(xì)胞排列緊密整齊；間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，未見明顯纖維增生。見圖1。

表5 各組大鼠血清TNF-α水平比較（n=6，pg·mL-1）Tab.5 Comparison of serum TNF-α levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表6 各組大鼠心臟重量、體重及HMI比較Tab.6 Comparison of heart weight,weight and HMI in each group

3 討論

高血壓病是一種常見的疾病，病因及其病理生理尚不明確。在傳統(tǒng)醫(yī)籍中并沒有該病的記載，因其常伴隨頭暈頭脹或頭痛等癥狀，故多將其歸為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“眩暈”“頭痛”的范疇。中醫(yī)常認(rèn)為它與稟賦不足、情志不遂、飲食失宜、勞倦過度等因素有關(guān)，其病機(jī)總屬本虛標(biāo)實，虛者常為肝腎陰虛、脾虛不運(yùn)，實者常為痰濁、血瘀、氣郁、肝風(fēng)等等，其中主要責(zé)之于肝、腎、脾。對于老年高血壓病患者而言，病機(jī)或有標(biāo)實顯著，然本虛甚者更占多數(shù)?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸埃ㄕ煞颍┪灏四I氣衰，發(fā)墮齒槁……（女子）五七，陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮……”說明脾腎等臟腑功能會隨年齡增長而逐漸發(fā)生不可逆的衰退，這也是老年高血壓病患者的本質(zhì)特征。膏方以其突出的滋補(bǔ)特性更適宜此類以本虛為主的輕中度老年高血壓患者。培補(bǔ)二天膏是以六味地黃丸與天麻鉤藤飲為基礎(chǔ)方，結(jié)合吳門醫(yī)派膏方經(jīng)驗創(chuàng)新而來，以補(bǔ)肝腎脾、化痰活血等治法為主，契合老年高血壓病患者的根本病機(jī)，在臨床治療中也取得較好療效。本研究選取的實驗動物為高齡SHR或WKY大鼠，也是為了盡可能貼近膏方的適用人群。

近年來的研究顯示，低度全身性炎癥對高血壓的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用[4]，而炎性細(xì)胞因子在其中扮演著重要的角色。作為促炎細(xì)胞因子，IL家族分子已被證實能夠通過不同機(jī)制升高血壓，如IL-1β能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化，改變細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)，并能夠增加VSMC細(xì)胞膜鈣離子通透性，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，促使血壓升高[5]。IL-2能夠促進(jìn)單核細(xì)胞釋放血管活性物質(zhì)，如血栓素A2等；同時可產(chǎn)生氧自由基，直接引起平滑肌收縮，或抑制內(nèi)皮依賴性舒張因子表達(dá)或?qū)е缕涫Щ睿罱K升高血壓[5]。IL-6則通過增加白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，提高血管阻力[6]；還能夠引起內(nèi)皮功能紊亂[7]，促進(jìn)平滑肌增殖，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，加強(qiáng)血管收縮[8]；同時能夠上調(diào)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受體表達(dá)，發(fā)揮縮血管作用[9]。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞病理結(jié)果比較（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological results of rat myocardial cells in each group（HE staining）

另一方面，心臟重構(gòu)作為高血壓病的靶器官損害，其病理改變主要包括心肌細(xì)胞肥大[10]、心肌細(xì)胞纖維化與凋亡[11]、心肌間質(zhì)纖維化[12]和冠狀動脈內(nèi)膜玻璃樣變、內(nèi)皮增生、中膜增厚、外膜纖維化[13]，以上病理生理過程也與IL家族密不可分。IL-6過表達(dá)可能通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 介導(dǎo)的 基質(zhì) 金屬蛋 白 酶2（matrix metalloprotein2，MMP2）/MMP3信號通路，誘導(dǎo)肌纖維母細(xì)胞增殖、分化和纖維化[14]。而IL-6拮抗劑能使特定培養(yǎng)基中心肌細(xì)胞表面積減少，并抑制成纖維細(xì)胞增殖，可見IL-6有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，誘導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)纖維化的作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 （cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞凋亡[16]。白細(xì)胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）介導(dǎo)的髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性信號通路主要激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[17]， 從而活化組織中的MMP，促進(jìn)間質(zhì)纖維化，同時通過反饋調(diào)節(jié)AngⅡ的合成，間接影響心室重構(gòu)[18]。IL-18能迅速誘導(dǎo)MMP基因（尤其是MMP-9）表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞間質(zhì)降解，導(dǎo)致心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化[19]；并且能夠增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，還能夠誘導(dǎo)心臟內(nèi)皮細(xì)胞死亡[20]。此外最重要的一點(diǎn)是，高血壓心臟重構(gòu)過程與血壓直接相關(guān)，血壓的降低能夠直接改善心臟重構(gòu)。

作為本研究的陽性對照藥物，厄貝沙坦通過拮抗AngⅡ1型受體發(fā)揮降壓療效，且能抑制AngⅡ。NF-κB信號通路作為炎性細(xì)胞因子合成的關(guān)鍵通路[21-22]，能夠被AngⅡ迅速激活[23]。因此通過抑制AngⅡ，厄貝沙坦能夠有效地抑制促炎細(xì)胞因子的生成，通過控制血壓、抑制炎癥反應(yīng)，改善心臟重構(gòu)。

本研究結(jié)果表明中、高劑量的培補(bǔ)二天膏具有明確的降壓療效，高劑量膏方能夠減低大鼠HMI，且病理學(xué)顯示膏方高劑量組及厄貝沙坦組心肌細(xì)胞肥大減輕，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤較陰性對照組及膏方低劑量組明顯減少，可見高劑量膏方能夠改善老年SHR的心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞肥大，由此提示高劑量膏方能夠改善SHR心臟重構(gòu)。血清炎性細(xì)胞因子水平的檢測則提示，培補(bǔ)二天膏能夠不同程度降低SHR血清IL-2、IL-1β、IL-6水平，而只有高劑量膏方能夠降低血清 TNF-α水平。由上可以推測，培補(bǔ)二天膏對IL家族的干預(yù)較明顯，而對TNF-α的影響相對較小。

綜上所述，本研究提示培補(bǔ)二天膏降低血壓的療效確切，而且能夠降低SHR血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平，高劑量時還能夠改善SHR心臟重構(gòu)，由此推斷其對心臟重構(gòu)的改善作用可能是通過降低血壓及炎性細(xì)胞因子水平實現(xiàn)的。