王 芬，成少寧，喬 冬

（運城職業(yè)技術大學 健康學院，山西 運城044000）

紫米又稱“紫珍珠”，米粒細長顏色紫黑，在我國湖南、云南、四川、貴州、陜西等地有少量栽培，是一種珍稀谷類。紫米味甘、性溫，《本草綱目》記載紫米有滋陰補腎、健脾暖肝、明目活血、抗癌和預防心臟病等作用[1]。與普通大米相比，紫米含有更為豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、礦物質(zhì)以及花色苷、黃酮類和酚酸類等生物活性物質(zhì)，使得紫米越來越受到消費者的青睞[2-6]。

酸奶作為一種以牛奶或乳粉為原料的發(fā)酵乳制品，因其營養(yǎng)豐富、風味獨特、含有活性乳酸菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進消化吸收等功能，在市場上廣受消費者歡迎，近兩年其產(chǎn)銷量增長速度均高達40%以上。隨著“健康中國2030”國民營養(yǎng)計劃的開啟，消費者的營養(yǎng)健康意識不斷增強，具有功能性的谷物酸奶的研究開發(fā)逐漸成為熱點[7-8]。目前關于紫米酸奶的研究報道比較少，付亮等[9]以西瓜汁和紫米漿為主要原料研制復合酸奶，通過正交試驗確定了最佳配方。

本試驗將紫米炒制、磨粉后加入牛奶中，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成一種營養(yǎng)豐富，風味獨特的功能性谷物酸奶，并對其工藝條件進行優(yōu)化，研究紫米酸奶在貯藏過程中品質(zhì)的變化及對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率，為紫米深加工探索新途徑，進一步豐富市場酸奶種類，具有重要的經(jīng)濟效益和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

鮮牛奶、白砂糖：市售；紫米：產(chǎn)自云南省墨江哈尼族自治區(qū)；保加利亞乳桿菌（Lactobncillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：運城職業(yè)技術學院微生物實驗室。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉、無水乙醇：廣東光華化學廠有限公司；氯化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、硫酸、無水乙醚、石油醚：天津市大茂化學試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；碘、氨水：南京化學試劑股份有限公司；試驗所用化學試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉粉3.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，1%中性紅溶液5.0 mL。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，七水合磷酸氫二鉀2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌15～20 min。

煌綠乳糖膽鹽肉湯（brilliant green lactose bile broth，BGLB）培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

1/10000g220gCPA224S電子分析天平：德國賽多利斯有限公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9203A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；PB-10 pH計：德國賽多利斯有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；GYB40-10S高壓均質(zhì)機：上海東華試驗儀器設備有限公司；722N-分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫米酸奶加工工藝流程及操作要點

紫米粉的制備：選取顆粒飽滿，無蟲害的紫米，淘洗一次，瀝干后，采用炒制機對紫米進行翻炒，再用高速萬能粉碎機進行粉碎，并過100目篩，得到熟紫米粉[10]。

鮮牛奶檢驗：按照GB 19301—2010《食品安全國家標準生乳》要求的方法對鮮牛乳的蛋白質(zhì)、脂肪、雜質(zhì)度、非脂乳固體、微生物等指標進行檢驗，檢驗結果均符合國標要求的鮮牛奶可作為原料乳。

混合、均質(zhì)、滅菌：將紫米粉加入檢驗合格的鮮牛奶中，高速攪拌機混合均勻，在65 ℃、20 MPa條件下均質(zhì)3 min，95 ℃滅菌15 min，得紫米鮮牛奶混合液。

接種、灌裝、發(fā)酵：將滅菌的混合液冷卻至42 ℃，加入菌種（保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1），灌裝，密封，放入42 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵4～6 h，待達到凝固狀態(tài)，酸度達到70°T時停止發(fā)酵[11-13]。

后熟：將發(fā)酵完畢的酸奶在4 ℃條件下冷藏24 h，得到紫米酸奶成品。

1.3.2 紫米酸奶的工藝優(yōu)化試驗

單因素試驗：以滴定酸度，持水力和感官評分為評價指標，研究紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量在不同水平上對紫米酸奶品質(zhì)的影響，確定每項因素的最優(yōu)值。設定白砂糖添加量為7%，接種量為0.05%，將紫米粉添加量設定為0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，考察紫米粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響；設定接種量為0.05%，紫米粉添加量為20 g/L，將白砂糖添加量水平設定為5%、6%、7%、8%、9%、10%，考察白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響；設定紫米粉添加量為20 g/L，白砂糖添加量為7%，將接種量水平設定為0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%，考察接種量對酸奶品質(zhì)的影響。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，以紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接種量（C）3個因素為試驗因素，酸奶的感官評分（Y）為響應值，采用Box-Behnken設計對紫米酸奶的工藝進行優(yōu)化，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 紫米酸奶的貯藏品質(zhì)測定

在最優(yōu)工藝條件下制備紫米酸奶，以不添加紫米的酸奶為對照，對酸奶進行感官評價及酸度、pH值、持水力、乳酸菌總數(shù)和DPPH自由基清除率測定，并測定紫米酸奶在0～4℃條件下貯藏0d、1d、5d、9d、13d、17d、21d的貯藏品質(zhì)。

1.3.4 分析檢測

（1）感官評價

邀請10名專業(yè)的品評人員對紫米酸奶進行感官評價，感官評價從色澤、組織狀態(tài)、氣味和滋味4個方面進行，滿分100分，結果以平均值計，紫米酸奶感官評分標準見表2。

表2 紫米酸奶感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of purple rice yogurt

續(xù)表

（2）理化指標測定

根據(jù)GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》中的指標要求，對酸奶中的脂肪含量、非脂乳固體含量、蛋白質(zhì)含量和酸度分別依據(jù)：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》、GB5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》和GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》進行測定；pH值測定：參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》；持水力測定：參考麻澤宇等[14]的方法進行測定。

（3）微生物指標測定

乳酸菌總數(shù)測定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》分別計數(shù)嗜熱鏈球菌數(shù)和保加利亞桿菌數(shù)，兩者之和即為乳酸菌總數(shù)。大腸菌群：按照GB4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》中的平板計數(shù)法進行測定。致病菌按照GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》和GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》中的方法進行測定。

（4）DPPH自由基清除率測定

參考胡錦濤等[15-18]的方法對紫米酸奶的DPPH自由基清除率進行測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紫米粉添加量對紫米酸奶品質(zhì)的影響

表3 紫米粉添加量對紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 3 Effect of purple rice flour addition on purple rice yogurt quality

由表3可知，紫米酸奶的酸度、持水力和感官評分隨著紫米粉添加量的增加，出現(xiàn)不同的變化。其中紫米酸奶的酸度隨著紫米粉添加量的增加而升高，這可能是因為紫米粉中的低聚糖等成分也可作為發(fā)酵基質(zhì)，促進了乳酸菌產(chǎn)酸量的增加；紫米酸奶的持水力隨著紫米粉添加量的增加而升高，這主要是因為紫米淀粉的吸水性較強，表現(xiàn)為酸奶的持水力逐漸升高；紫米酸奶的感官評分隨著紫米粉添加量的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當紫米粉添加量達到20 g/L時，酸奶呈乳白色略帶紫色，既有發(fā)酵乳的香味又有紫米香味，組織細膩無乳清析出，當紫米粉添加量＞20 g/L時，酸奶紫米氣味過重、掩蓋酸奶的香味、組織粗糙且紫米淀粉經(jīng)過糊化冷卻后，導致酸奶凝乳不佳出現(xiàn)分層。因此，紫米粉添加量20 g/L為宜。

2.1.2 白砂糖添加量對紫米酸奶品質(zhì)的影響

表4 白砂糖添加量對紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 4 Effect of sucrose addition on purple rice yogurt quality

由表4可知，隨著白砂糖添加量的增加，酸奶的酸度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，這是由于白砂糖含量的增加為乳酸菌的生長提供了充足的碳源，促進了乳酸菌的產(chǎn)酸從而導致酸度增大。隨著白砂糖添加量的增加，酸奶的持水力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在白砂糖添加量達到7%時，酸奶的持水力達到最高。酸奶的感官評分隨著白砂糖添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在白砂糖添加量達到7%時，酸奶的感官評分達到最高，此時產(chǎn)品酸甜可口，口味最佳。當白砂糖添加量＞7%，酸奶口感偏甜，感官評分下降。因此，白砂糖添加量7%為宜。

2.1.3 接種量對紫米酸奶品質(zhì)的影響

表5 接種量對紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 5 Effect of inoculum on purple rice yogurt quality

由表5可知，當接種量＜0.05%時，制作的酸奶產(chǎn)酸量少，持水力差，凝乳狀態(tài)不佳，酸奶組織不細膩，乳清析出較多，酸奶感官評分不高。當接種量達到0.05%時，乳酸菌產(chǎn)酸量增加，此時制作的酸奶酸度升高，酸奶凝固狀態(tài)良好，持水力增加，組織細膩，感官評分最高。當接種量＞0.05%時，隨著接種量的增加，乳酸菌產(chǎn)酸過多，口感偏酸，酸奶凝乳過度，導致乳清析出，持水力和感官評分均下降。因此，接種量0.05%為宜。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

選取紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接種量（C）3個因素為自變量，酸奶的感官評分（Y）為響應值，依據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，對紫米酸奶的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。利用Design-Expert V8.0.6 軟件，對試驗結果進行多元二次擬合分析以及方差分析，Box-Behnken試驗設計結果見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計結果Table 6 Results of Box-Behnken experiments design

利用Design-Expert V8.0.6軟件，對表6結果進行多元二次擬合分析，得回歸方程：Y=90.06+1.05A+1.54B+1.04C-0.20AB+0.50AC+0.38BC-2.57A2-2.49B2-1.24C2。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，酸奶工藝優(yōu)化回歸模型（P值=0.0001＜0.01），模型極顯著，失擬項（P值=0.843 5＞0.05）不顯著，表示試驗操作誤差很小，其決定系數(shù)為R2=0.970 9，說明該模型是擬合良好的模型，可以用于紫米酸奶的工藝優(yōu)化。分析各因素的F值和P值可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對紫米酸奶感官評分影響均極顯著（P＜0.01）。對A、B、C三個因素影響程度分析可知：B＞A＞C，即白砂糖添加量＞紫米粉添加量＞接種量。

2.2.1 響應面曲面分析

紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量三個因素之間的交互作用的響應面及等高線見圖1。由圖1可知，3個響應面圖都是開口向下的，說明紫米酸奶感官評分在試驗設計的范圍內(nèi)存在最大值。根據(jù)Design-Expert V8.0.6軟件分析得出紫米酸奶的最佳配方工藝為紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接種量0.06%。在此優(yōu)化條件下，紫米酸奶的感官評分預測值為90.7分。

圖1 紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量交互作用對紫米酸奶感官品質(zhì)影響的響應面及等高線Fig. 1 Response surface plots and contour lines of the interaction between purple rice power addition, sugar addition and inoculum on sensory quality of purple rice yogurt

2.2.2 紫米酸奶工藝配方優(yōu)化驗證試驗

在紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接種量0.06%的工藝條件下進行驗證試驗，進行3次平行試驗取平均值得到感官評分實際值為91.1分，真實值與回歸模型預測值之間的偏差是0.4%（＜1%），說明此模型良好。

2.2.3 紫米酸奶品質(zhì)分析

按照GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》中的指標要求對最佳工藝制作的紫米酸奶的脂肪、非脂乳固體、蛋白質(zhì)、酸度、乳酸菌總數(shù)、大腸菌群和致病菌進行檢測，結果見表8。

表8 紫米酸奶理化及微生物指標檢測結果Table 8 Determination results of physicochemical and microbial indicators of purple rice yogurt

由表8可知，紫米酸奶的理化及微生物指標均滿足國標GB 19302—2010要求，表明用最佳工藝制作的紫米酸奶營養(yǎng)豐富、品質(zhì)良好。

2.3 紫米酸奶的貯藏品質(zhì)

由圖2a～圖2d可知，在貯藏期間紫米酸奶和對照酸奶的感官評分和持水力均隨著貯藏時間的延長而下降，而紫米酸奶的感官評分和持水力均高于對照酸奶。在pH值和酸度兩個指標方面，紫米酸奶的pH值高于對照酸奶，隨著貯藏時間的延長pH值均呈下降趨勢；紫米酸奶的酸度低于對照酸奶，隨著貯藏時間的延長均呈上升的趨勢。由圖2e可知，紫米酸奶的乳酸菌總數(shù)在貯藏期間一直高于對照酸奶，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且均在貯藏13 d時達到最大值。說明紫米粉能促進乳酸菌的增殖，紫米酸奶的貯藏品質(zhì)優(yōu)于對照酸奶。由圖2f可知，紫米酸奶對DPPH自由基清除率高于對照酸奶，且兩者均隨著貯藏時間的延長而呈現(xiàn)上升的趨勢。這是因為酸奶在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多肽、氨基酸具有一定的抗氧化能力[19]，而紫米中的花色苷、黃酮類和酚酸類生理活性物質(zhì)具有較強的抗氧化能力[20-21]，因此紫米粉的添加可以增加酸奶的DPPH自由基清除率。在酸奶貯藏期間，隨著發(fā)酵的進行，酸奶中的抗氧化成分不斷增加，使得兩種酸奶對DPPH自由基清除能力不斷增強。

圖2 紫米酸奶貯藏期間品質(zhì)變化Fig. 2 Changes of purple rice yogurt quality during storage

3 結論

在單因素試驗基礎上，響應面法得到紫米酸奶最優(yōu)的工藝為紫米粉添加量為22 g/L，白砂糖添加量為7%，接種量為0.06%。在此工藝條件下，紫米酸奶的感官評分為91.1分，與理論預測值90.7分比較接近，表明該模型擬合程度較好。紫米酸奶品質(zhì)分析結果顯示，紫米酸奶的各項品質(zhì)指標均符合國標要求。在貯藏期間，紫米酸奶的感官評分、持水力、pH、酸度、乳酸菌總數(shù)均優(yōu)于對照酸奶，且紫米酸奶的DPPH自由基清除率明顯高于對照酸奶。紫米酸奶是一款貯藏品質(zhì)穩(wěn)定，具有更長的貨架期和較強抗氧化能力的谷物酸奶。