何錫然 譚曉宇 張琳 鄺偉鍵 劉華敏 陳素平 郭家钘 梁銘炬 周偉津 霍楓

肝移植已經(jīng)成為終末期肝臟疾病的主要治療手段[1-2]。伴隨肝移植手術(shù)例數(shù)的激增，供肝相對短缺的問題日益突出。因此，移植中心已經(jīng)越來越多地轉(zhuǎn)向于使用擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)供體和心死亡供體(donation after circulatory death，DCD)的器官。目前，中國42.98%的器官供體屬于DCD[3]。但是傳統(tǒng)的靜態(tài)冷保存并不能有效保存DCD肝臟，而且長時(shí)間的冷保存會(huì)增加缺血再灌注損傷、移植物早期功能障礙、原發(fā)性無功和缺血性膽管病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致移植失敗和患者死亡[4-5]。

體外常溫機(jī)械灌注(normothermic machine perfusion，NMP)作為一種新的保存技術(shù)，近幾年已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[6-8]。但是，該技術(shù)操作難度較大，且缺乏統(tǒng)一的實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)，包括灌注溫度、灌注液配方及灌注控制的模式等[9]。目前，NMP模式主要為壓力控制[10]。在壓力模式下，由于門靜脈的壓力較低，一旦壓力測量出現(xiàn)偏差，會(huì)對流量造成較大的影響，過低的流量會(huì)導(dǎo)致肝臟營養(yǎng)供應(yīng)不足，過高的流量會(huì)導(dǎo)致肝竇過度擴(kuò)張，從而導(dǎo)致剪應(yīng)力，破壞內(nèi)皮細(xì)胞線性，進(jìn)而會(huì)干擾實(shí)質(zhì)細(xì)胞的保存效果，提示門靜脈恒流模式可能更有利于肝臟灌注。因此，本實(shí)驗(yàn)對比門靜脈恒壓和恒流模式下對熱缺血60 min肝臟常溫灌注的效果，初步探索兩種模式在供肝保存上的差異。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康巴馬小型豬12只，雌性，體質(zhì)量45～50 kg，由解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(陸總)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每頭實(shí)驗(yàn)豬既用作血液的供體，又用作肝臟的供體。實(shí)驗(yàn)操作過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)灌注設(shè)備 由廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院(廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院)、中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)的常溫機(jī)械灌注設(shè)備(DEVOCEAN-LIVER 2000)可以對離體肝臟進(jìn)行肝動(dòng)脈和門靜脈雙重灌注，主要構(gòu)建部件如下：2個(gè)離心泵；2個(gè)氧合器；溫度傳感器；2個(gè)壓力傳感器；2個(gè)流量傳感器；2個(gè)濾血栓；溫控水箱；自制的儲(chǔ)肝器、自制的灌注管路以及自制門靜脈、肝動(dòng)脈、膽管插管等。

(二)豬血液及肝臟獲取 在誘導(dǎo)麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針建立輸液通道，利用微量注射泵以每小時(shí)2～5 mg/kg的劑量泵入丙泊酚維持麻醉。氣管插管，連接呼吸機(jī)。腹部正中線切口進(jìn)腹，游離腹主動(dòng)脈、下腔靜脈及門靜脈。于腹主動(dòng)脈和下腔靜脈置入已剪開口的16-Fr導(dǎo)尿管取血，血液過濾去除白細(xì)胞。靜置實(shí)驗(yàn)豬60 min。熱缺血60 min后，結(jié)扎胸主動(dòng)脈，于腹主動(dòng)脈和門靜脈置入插管，進(jìn)行在體冷灌注。快速取下肝臟，修整肝門區(qū)多余組織，剔除肝門區(qū)域的淋巴結(jié)，進(jìn)行肝動(dòng)脈和膽道插管，記錄肝臟重量。

(三)常溫機(jī)械灌注液和常溫機(jī)械灌注參數(shù)設(shè)定 灌注液由豬全血1500 mL，150 mL羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液，800 U肝素鈉注射液，1 g注射用頭孢西丁鈉組成。灌注之前灌注管路內(nèi)用150 mL羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液混合部分全血進(jìn)行預(yù)充，排除管路中的氣泡。肝臟連接儀器，門靜脈恒壓組(n=6)，門靜脈壓力設(shè)定為6～8 mmHg，門靜脈恒流組(n=6)，門靜脈流量設(shè)定為0.5 mL/min/g。兩組肝動(dòng)脈均采用恒壓脈沖式灌注，灌注壓力為60/80 mmHg，灌注6 h，灌注溫度為37℃。記錄冷缺血時(shí)間(從在體冷灌注至肝臟上機(jī)所需的時(shí)間)。

(四)觀察指標(biāo) 灌注過程中每2小時(shí)取灌注液，離心后留血漿進(jìn)行血?dú)饧吧瘷z測，分析酸堿度、血糖、乳酸、尿素氮、TBil、ALT、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等指標(biāo)變化趨勢。記錄灌注過程中每小時(shí)產(chǎn)生的膽汁量。灌注過程中，每2小時(shí)取肝組織留作組織病理學(xué)檢查，根據(jù)鈴木評分以及其他文獻(xiàn)介紹的辦法，從淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴(kuò)張等方面進(jìn)行評分，每個(gè)方面分為無、輕度、中度和重度，分別評分0、1、2、3，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行雙人評分，最后統(tǒng)計(jì)每項(xiàng)得分以及總得分[11-13]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，比較采用t檢驗(yàn)，若方差不等，則采用近似t檢驗(yàn)，若樣本不服從正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、灌注前兩組肝臟的對比

灌注前，門靜脈恒壓組的冷缺血時(shí)間為(100.50±24.32)min，門靜脈恒流組的冷缺血時(shí)間為(83.50±26.51)min，(P>0.05)，表明兩組肝臟灌注前的缺氧情況無差異，兩組可比。

二、灌注過程的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

兩組肝動(dòng)脈均采用恒壓灌注模式，門靜脈恒壓組的平均肝動(dòng)脈流量為(0.13±0.08)mL/(min·g)(肝重)，而門靜脈恒流組的肝動(dòng)脈流量為(0.25±0.09) mL/(min·g)(肝重)，其中灌注5 h和6 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組的肝動(dòng)脈流量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。門靜脈恒壓組的平均門靜脈流量為(0.78±0.19)mL/(min·g)，而恒流組的則為(0.54±0.07)mL/(min·g)，門靜脈恒壓組的平均門靜脈壓力為(7.59±0.17)mmHg，而恒流組的則為(5.16±0.84)mmHg，由于兩組門靜脈控制模式不同，未對門靜脈流量和壓力進(jìn)行比較。

圖1 離體豬肝常溫機(jī)械灌注過程中肝動(dòng)脈流量

三、灌注過程兩組血?dú)馍笜?biāo)以及膽汁生成量對比

在灌注過程中，兩組的pH值均穩(wěn)定維持在生理值水平附近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乳酸水平在恒流組中較低，但兩組在灌注過程的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組的血糖水平均呈先升高后下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而兩組的BUN在灌注過程中逐步升高，說明兩組肝臟能夠進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)代謝，除了灌注初期的第2小時(shí)，兩組灌注后期的BUN水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在灌注過程中，兩組的TBil 變化平穩(wěn)，未出現(xiàn)明顯上升，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組在灌注結(jié)束時(shí)(6 h)肝細(xì)胞酶學(xué)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示兩組肝細(xì)胞受損水平相當(dāng)。恒壓組6 h積累膽汁生成量為(6.98±3.20) mL，恒流組6 h積累膽汁生成量為(54.47±15.63) mL，兩組的每小時(shí)膽汁累積生成量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 離體豬肝常溫機(jī)械灌注過程中灌注參數(shù)和代謝指標(biāo)

四、灌注過程兩組病理學(xué)的改變

灌注結(jié)束時(shí)，兩組的鈴木評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是恒流灌注組呈較有規(guī)律的下降趨勢。從淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴(kuò)張等單項(xiàng)評分觀察，雖然恒流灌注組在灌注結(jié)束時(shí)的平均值低于恒壓組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病理改變見圖3。

圖3 離體豬肝常溫機(jī)械灌注過程中的病理切片(×200) a-b. 豬肝臟門靜脈恒壓組NMP 0 h和6 h肝組織；c-d. 豬肝臟門靜脈恒流組NMP 0 h和6 h肝組織

討 論

目前國外的研究結(jié)果提示NMP比傳統(tǒng)靜態(tài)冷保存具有以下優(yōu)勢：①延長器官保存時(shí)間，②改善肝臟功能，③體外檢測肝臟活力，④具有通過添加藥物來修復(fù)受損肝臟的潛力，⑤完善肝移植的手術(shù)時(shí)間安排[4, 5, 14-16]。

本實(shí)驗(yàn)對NMP的門靜脈灌注模式進(jìn)行了初步的探索，對比了壓力恒定和流量恒定兩種模式對DCD肝臟常溫灌注的影響。在冷缺血時(shí)間可比的前提下，兩組灌注過程的血?dú)夂蜕笜?biāo)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明相比主流的壓力控制模式，流量控制模式未使肝臟出現(xiàn)明顯的異常情況，而且各種指標(biāo)變化均比較平穩(wěn)，提示流量控制模式并不劣于壓力控制模式的替代模式。在膽汁生成方面，流量控制模式似乎顯露出其優(yōu)勢。在本研究中，門靜脈恒流組的膽汁生成量比恒壓組高，提示維持門靜脈穩(wěn)定的灌注可能更有利于肝細(xì)胞進(jìn)行膽汁的合成。門靜脈對血流的自身調(diào)節(jié)能力有限，而肝動(dòng)脈則具有較強(qiáng)的血流自身調(diào)節(jié)能力。門靜脈血流變化會(huì)引起肝動(dòng)脈血流出現(xiàn)相應(yīng)變化，即肝動(dòng)脈緩沖效應(yīng)，大量研究發(fā)現(xiàn)，小體積供肝移植術(shù)后早期，門靜脈高灌注可引起肝動(dòng)脈血流顯著下降，從而導(dǎo)致膽道缺血、小葉微小血管脂肪變，最終導(dǎo)致移植肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞壞死，再次減少有效肝體積[17]?？刂崎T靜脈流量更有利于維持肝動(dòng)脈的流量，

從而更利于肝細(xì)胞以及膽管的供氧，進(jìn)而更利于肝臟進(jìn)行正常代謝。

在病理學(xué)方面，流量恒定模式的淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴(kuò)張的評分與壓力恒定模式相當(dāng)。Vekemans等[18]利用豬動(dòng)物模型和低溫機(jī)械灌注探索了流量對肝臟的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高流量組在灌注4 h后出現(xiàn)空泡，低門靜脈流量聯(lián)合氧氣組在12 h后肝竇仍保持完整，空泡數(shù)量較少。而且低門靜脈流量聯(lián)合氧氣組更有利于維持ATP水平。在組織病理學(xué)方面，高流量組灌注引起了更嚴(yán)重的肝竇擴(kuò)張。說明低門靜脈流量聯(lián)合氧氣組不僅有助于改善肝組織缺氧情況，而且能夠在適當(dāng)打開微循環(huán)的情況下維持肝實(shí)質(zhì)的完整性。Hart等[19]利用鼠肝臟探索了低溫灌注下最合適的壓力，結(jié)果表明25%的壓力可以達(dá)到100%的灌注，而且灌注24 h后，與50%的相比，25%的灌注壓力導(dǎo)致的死細(xì)胞數(shù)量更少，以上結(jié)果表明較低的灌注壓力不僅能夠維持肝臟的有效灌注，而且能夠減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，提示肝臟的離體灌注需要避免過量灌注。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對比了門靜脈恒壓灌注和恒流灌注在DCD肝臟上的灌注效果，結(jié)果表明流量控制模式并不劣于主流的壓力控制模式，血?dú)夂蜕笜?biāo)穩(wěn)定，而且流量控制模式可能更有利于肝臟的供血，從而促進(jìn)肝細(xì)胞進(jìn)行膽汁合成。由于目前尚無統(tǒng)一評價(jià)體外灌注肝臟質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，因此項(xiàng)目組未來將開展動(dòng)物肝移植實(shí)驗(yàn)以及臨床肝移植試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證以上假設(shè)。