張蓉

（江蘇碩世生物科技股份有限公司上海分公司，上海201114）

宮頸癌是女性第二常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，也是目前唯一一個病因明確的惡性腫瘤[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，2018 年估計有57 萬例新病例，占所有女性癌癥死亡人數(shù)的7.5%。每年估計超過31.1 萬例死于宮頸癌，超過85%發(fā)生在欠發(fā)達地區(qū)[2]。在發(fā)達國家，女性可以接受針對人乳頭瘤病毒的疫苗接種，并可以對婦女進行定期篩查，在易于治療的階段識別出癌前病變。因此可以大大降低宮頸癌的發(fā)生。人乳頭瘤病毒（HPV）是一種主要存在于人皮膚、黏膜及女性宮頸上皮細胞異形區(qū)的病毒。1995 年國際癌癥研究機構（IARC）正式宣布HPV 某些型別持續(xù)性感染是導致宮頸癌的最主要因素。WHO 把與宮頸癌發(fā)生有關的HPV 型別稱為高危型，有HPV 16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82等；與腫瘤不相關的稱為低危型，最常見的為HPV 6, 11 和81等。研究提示在宮頸癌的發(fā)生中16、18 等高危型的致癌性遠遠高于其他型別[3-4]。美國陰道鏡和宮頸病理學會將16 和18 型陽性列為病理學檢測指癥。病毒載量被認為是中度宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ）或更高級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變的潛在生物指征。本研究開發(fā)一個試劑盒，用于研究HPV 型別及載量在臨床上的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床樣本及參考品

因暫無人乳頭狀瘤病毒體外培養(yǎng)技術，本研究采用HPV16型國際標準品、宮頸腺癌細胞Hela 細胞、鱗癌細胞Siha、重組HPV 質粒及臨床樣本等進行性能評估。采用的樣本來源于2011.07～2013.12 期間臨床醫(yī)療機構收集的宮頸脫落細胞剩余樣本。

1.1.2 儀器

SLAN-96P 熒光定量PCR 儀購買自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.1.3 試劑

人乳頭瘤病毒核酸分型定量檢測試劑盒（熒光PCR 法）自主研發(fā)，采用實時熒光PCR 技術，主要以HPV L1 區(qū)為靶區(qū)域，可一次性檢測21 種常見HPV 高、中、低危型及取樣細胞數(shù)，并通過參考基因與待測細胞的線性關系獲得HPV16 型在單位細胞中的載量。

1.2 方法

1.2.1 試劑性能驗證

性能評估包括最低檢測限、HPV 分型準確度、HPV16 型定量準確度、線性范圍、特異性、精密度評價等。

a.最低檢測限：采用陽性參考品進行梯度稀釋確定本試劑盒的靈敏度。將一定濃度的HPV 陽性參考品進行10 倍倍比稀釋，用于反應體系靈敏度的確定，當陽性檢出率≥95%時的濃度即為試劑盒的最低檢出限。另外，采用21 個HPV 國家標準品進行梯度稀釋至最低檢測限濃度（1×104copies/ml，等同于20copies/反應），重復檢測20 次，以驗證本試劑盒的最低檢測限。

b.HPV 分型準確度：采用細胞系、20 個HPV 型別國家標準品和HPV68 型參考品對試劑盒的分型準確度進行評價。

c.定量準確度：采用HPV16 型國際標準品（1×107IU/ml）、人白細胞樣本、HPV16 型定量參考品（濃度為104copies/mL，104個/mL 白細胞作為基質）分別對HPV16 型、參考基因以及HPV16型感染單位的定量準確性進行驗證。以上量值進行測定后，按照B=M-T 公式（B- 絕對偏差；M- 測試結果均值；T- 參考物質標示值）進行計算。絕對偏差均不超過±0.5 個對數(shù)數(shù)量級為量值準確度的標準。

d.線性范圍：分別對HPV16 型定量參考品和參考基因的線性范圍進行研究，將1×1012copies/ml 濃度的HPV16 型、參考基因質粒分別進行梯度稀釋，使用多項式回歸分析判斷校準曲線是否具有線性，根據(jù)R2大于0.995 從而判斷本試劑盒的檢測范圍。

e.特異性驗證：采用本研究試劑盒檢測與人乳頭瘤病毒感染部位相同、癥狀相似的病原體及于試劑盒檢測范圍之外的其它病原體來驗證試劑盒的特異性，細菌的濃度為106cfu/ml，病毒的濃度為105pfu/ml，HPV 特異性型別的濃度為106copies/ml。檢測宮頸脫落細胞樣本中可能存在的干擾物質，具體組分和濃度如下表1。

表1 干擾物質及病原體

f. 精密度評價：采用精密性參考品對試劑盒進行精密度評估，每份參考品重復檢測20 次。對熒光PCR 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，評價批內(nèi)、批間變異系數(shù)，要求變異系數(shù)CV 小于5%（定量采用濃度對數(shù)計算）。

1.2.2 臨床試驗

試驗共采集2140 份樣本進行本試劑盒的定性檢測，其中508 份HPV16 型樣本進行定量檢測*。通過與 人乳頭狀瘤病毒(HPV)分型檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)）的一致性評價來確定試劑盒的有效性。另外，以病理或細胞學結果為金標準，進行HPV16 型定量結果的評價。將病理學結果按照宮頸癌的病變程度分為4 個等級：第1 組為未見上皮病變或惡性改變（NILM）；第2 組為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）；第3 組為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）；第4 組為癌癥。觀察不同病毒等級組間的差異，以病理等級為金標準，驗證HPV16 型載量臨床Cutoff 值（16600拷貝/10000 個細胞）的靈敏度和特異性。

注：*其中的一家中心817 份樣本數(shù)據(jù)（包含313 例HPV16型，用于定量分析）已經(jīng)發(fā)表在BMC Cancer[5]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學分析。計算計量資料的均數(shù)、方差、標準差和CV，以及臨床一致性的陽性符合率、陰性符合率、總符合率、Kappa 值。

2 結果

2.1 試劑性能驗證

2.1.1 最低檢測限

本研究對反應體系的靈敏度進行驗證，對實驗結果進行統(tǒng)計分析，濃度為1×104copies/ml 的21 個HPV 國家標準品檢出率分別都大于95%。因此本試劑盒反應體系的靈敏度確定為1×104copies/ml（20 copies/反應）。

2.1.2 HPV 分型準確度

檢測以上參考品，陽性符合率和陰性符合率均為100%。

2.1.3 定量準確度

分別對HPV16 型定量準確度、參考基因定量準確度以及HPV16 型感染單位（拷貝數(shù)/10000 細胞）量值測定結果如下表2，實驗結果表明，試劑盒對HPV16 型國際標準品、參考基因以及HPV16 型感染單位的濃度的絕對偏差均不超過±0.5 個對數(shù)數(shù)量級，符合試劑盒性能要求。

2.1.4 線性范圍

確定HPV16 型的線性范圍是1×1010copies/ml 至1×104copies/ml，參考基因的線性范圍是5×109copies/ml 至2×103copies/ml，當處于以上濃度范圍時，所有點都處于一條直線上，線性相關系數(shù)R2大于0.995。

2.1.5 特異性驗證

與人乳頭瘤病毒感染部位相同、癥狀相似的病原體及于試劑盒檢測范圍之外的其它病原體均無交叉。干擾物質研究時，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗組P 值均大于0.05，差異不顯著，說明以上濃度干擾物質對試劑盒的分型和定量檢測沒有影響。

2.1.6 精密度評價

采用3 個批次試劑，驗證試劑盒的批內(nèi)和批間精密度，其變異系數(shù)CV 均小于5%。說明本研究試劑精密度較高。

2.2 臨床對比評價結果

2.2.1 人乳頭瘤病毒分型檢測結果

在2140 例臨床檢測樣本中，陽性樣本數(shù)最多的前4 個型別分別是16 型（630 例）、52 型（423 例）、58 型（286 例）、18 型（217例）。對兩種方法進行一致性評價，總體陽性符合率為91.2%，陰性符合率為98.2%，總符合率為97.7%，Kappa 值為0.823。其中HPV16、18、31、66、53、33、58、45、52、68、39、6、11 的檢出結果一致性較好，kappa 系數(shù)均大于0.75(P＜0.05)。差異樣本經(jīng)基因測序驗證，得知對于兩種試劑盒結果中21 個型別不符的樣本有944 例（同一樣本有多型別不符按多個納入統(tǒng)計），對照試劑的準確率為17.90%，本研究方法準確率為82.10%。一致性較低的HPV59、56、35、51、81，均為對照試劑漏檢導致，因此可以明顯看出本方法在分型方面靈敏度及準確率明顯優(yōu)于對照試劑。

2.2.2 HPV16 載量與病理等級的相關性

對508 例HPV16 樣本的定量結果按照病理學等級進行分級，1-4 級的病毒感染單位中位數(shù)為2128（245 例）、45622.93（78例）、84721.2（115 例）、92846.35（70 例）。通過Wilcoxon 檢驗進行1 級與2-4 級間的差異性分析，結果P 值小于0.0001，表明病理等級在CINⅠ-Ⅱ以上（2-4 級）同病理檢查正常、炎癥間病毒感染量有顯著性差異。

將HPV16 型樣本的檢測載量按產(chǎn)品的臨床Cutoff 值劃分為陽性和陰性，以病理結果為標準分析載量預測的效果。其靈敏度為72.62%，特異度為72.24%。HPV16 型定量檢測通過cutoff值判定病理等級CINⅠ- Ⅱ及以上等級的準確率在72.44%（68.33%～76.28%），對臨床診斷有一定輔助意義。

表2 定量準確度參數(shù)

3 討論

就大多數(shù)患者而言，從感染到最終宮頸癌的發(fā)生存在一個緩慢的潛伏期，因此，及時定期檢測宮頸脫落細胞中HPV 的有無及載量的變化在宮頸癌的早期篩查、輔助診斷和愈后評估等環(huán)節(jié)中顯得尤為重要。本研究研制的“人乳頭瘤病毒核酸分型定量檢測試劑盒（熒光PCR 法）”采用熒光定量PCR 技術對適齡婦女進行宮頸癌的早期篩查，對HPV21 個型別進行核酸水平的分型和定量分析。從性能評價和臨床驗證結果可以看到試劑盒各項性能指標均符合要求，與臨床已上市產(chǎn)品相比，HPV 型別檢測的一致性較高。

而關于HPV 型別載量與宮頸疾病進程相關性一直是近年來研究的關注點，Kim J 等研究推測在HPV 16、18 和58 感染病例中，型別特異性病毒載量可能是一個強有力的HSIL+診斷指標，如果在所有其他高危HPV 型中也得到證實，病毒載量檢測可能導致細胞學異常的診斷策略發(fā)生轉變[6]。在HPV16 感染的患者中，病毒載量與高級別上皮內(nèi)病變或宮頸癌相關，這可以作為腫瘤進展和宮頸癌篩查的有效預測生物標志物[7]，且研究提示于高病毒載量的患者，特定的隨訪可能有用[8]。本研究根據(jù)臨床數(shù)據(jù)，也提示通過HPV16 型病毒載量預測病理等級CINⅠ-Ⅱ及以上等級的準確率在72.44%，病毒載量的測試可以用于疾病進程的分流中，具有一定的臨床診斷意義。且本方法具有操作簡單、快速、自動化程度高等特點，適合于臨床HPV DNA 檢查和大規(guī)模的樣本篩查，為人乳頭瘤病毒的快速篩查提供更有效的輔助手段。