凌娜，Stephen Forsythe，吳清平*，丁郁，張菊梅，曾海燕

1. 引言

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.）由7個(gè)具有致病性的菌種組成，分別為阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C. malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）、莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）、康帝蒙提克羅諾桿菌（C.condimenti）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）和都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis），原先統(tǒng)稱為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）。而C. sakazakii是Cronobacterspp.中感染性最強(qiáng)的一個(gè)菌種[1]。Cronobacterspp.是一類具有周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，在好氧和厭氧條件下均可生長的革蘭氏陰性桿菌。該菌可引起各個(gè)年齡人群感染，特別是在新生兒、小于6個(gè)月的嬰兒和老年人中的感染率較高。由于C. sakazakii與新生兒嚴(yán)重疾病的感染暴發(fā)密切相關(guān)，因此該菌已引起監(jiān)管當(dāng)局的高度重視。國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（International Commission on Microbiological Specification for Foods, ICMSF）將Cronobacter列為“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的一種致病菌”[2]。該菌可導(dǎo)致低出生體重新生兒和年齡小于6個(gè)月（斷奶前）的嬰兒患腦膜炎、壞死性腸炎和呼吸道感染等威脅生命的癥狀，其中伴有神經(jīng)后遺癥或迅速死亡病癥的死亡率為40%～80% [3?7]。此外，C.sakazakii也會感染其他年齡人群，盡管已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)該菌可在學(xué)生中暴發(fā)急性腸胃炎，但其主要的感染人群是免疫功能低下的成年人[8]。該菌可導(dǎo)致成人多種癥狀，如菌血癥、闌尾炎、敗血癥、骨髓炎、肺炎、脾膿腫、傷口感染和尿路感染[5,9]。

C. sakazakii廣泛分布于環(huán)境中，包括嬰幼兒配方奶粉（powdered infant formula, PIF）、蔬菜、即食食品、水、干糧、藥用植物、香料和蒼蠅[10?19]。由于Cronobacter具有強(qiáng)抗干燥能力，能夠產(chǎn)生多糖莢膜，并分泌黃色類胡蘿卜素色素以保護(hù)其抵抗氧自由基的侵害，所以研究者推測該菌的主要自然源可能是植物[20]。此外，在家庭環(huán)境[21,22]和食品生產(chǎn)設(shè)備[23,24]中也均發(fā)現(xiàn)了該菌。

為了適應(yīng)不同的生長環(huán)境，細(xì)菌形成稱為生物膜（biofilm）的動(dòng)態(tài)空間組織。這是微生物重要的適應(yīng)性生存策略，食源性病原體可以通過這種策略保護(hù)自己免受環(huán)境脅迫[25?27]。生物膜中的細(xì)菌作為一個(gè)群落存在，其生理特性不同于浮游態(tài)的細(xì)菌。它們在細(xì)胞-細(xì)胞間進(jìn)行合作與競爭，相互傳遞信號分子，并進(jìn)行基因的水平轉(zhuǎn)移。因此，它們保持“亦敵亦友”的關(guān)系[28]。生物膜的獨(dú)特形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)因其包含的微生物及駐留的微環(huán)境條件而異。細(xì)胞在生物膜內(nèi)的變化是通過感知和響應(yīng)各種外部環(huán)境信號而實(shí)現(xiàn)，通過對這些環(huán)境信號的交互響應(yīng)，細(xì)菌能夠協(xié)調(diào)其基因表達(dá)并適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。

研究表明，C. sakazakii可以附著在硅、乳膠、聚碳酸酯、不銹鋼、玻璃、聚氯乙烯等非生物材料表面并形成生物膜[29,30]。值得注意的是，C. sakazakii在PIF中的存活和持續(xù)污染與該菌引起的感染暴發(fā)密切相關(guān)。因此，C. sakazakii需具有適應(yīng)PIF嚴(yán)苛的高滲透和強(qiáng)干燥條件的能力。Beuchat等[31]發(fā)現(xiàn)，C. sakazakii的生物膜態(tài)細(xì)胞在低濕度條件下比其浮游細(xì)胞生存力更強(qiáng)。在奶粉加工廠的環(huán)境（空氣過濾器、地板、鞋子、卡車、屋頂）和加工設(shè)備（滾筒烘干機(jī)、空氣過濾器）中均能檢測到該菌，并且該菌可能會在這些物質(zhì)上存留幾個(gè)月。此外，C. sakazakii也會在新生兒喂食管上形成生物膜，這可能會增加新生兒獲得感染的風(fēng)險(xiǎn)[32]。近期，生物膜狀態(tài)被認(rèn)為是細(xì)菌的默認(rèn)生活方式，而浮游態(tài)細(xì)胞可能只是細(xì)菌生命的一個(gè)過渡階段[33]。而食品微生物污染主要與食品接觸面上細(xì)菌生物膜的形成有關(guān)。整個(gè)食品加工鏈中接觸面上的物質(zhì)可以為生物膜的發(fā)展和持留提供堅(jiān)實(shí)的基質(zhì)，從而難以去除的生物膜將導(dǎo)致食品的細(xì)菌污染并對消費(fèi)者構(gòu)成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何防控由C. sakazakii生物膜引起的食品污染是食品行業(yè)亟待解決的共性關(guān)鍵難題。

以往對生物膜的研究重點(diǎn)關(guān)注生物膜及控制食品污染的方法研究。近年來，多組學(xué)研究和成像技術(shù)的快速發(fā)展揭示了細(xì)菌生物膜內(nèi)復(fù)雜的空間組織及其形成過程，更準(zhǔn)確地了解生物膜將為生物膜去除方法的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。然而，由于目前對C. sakazakii的研究仍處于初級階段，因此，對其生物膜的控制手段尚不明確。本文根據(jù)C. sakazakii生物膜現(xiàn)有的研究進(jìn)行系統(tǒng)性的概況，包括生物膜形成機(jī)制、傳統(tǒng)和創(chuàng)新的生物膜控制策略以應(yīng)對生物膜面對的挑戰(zhàn)，并討論了如何將這些控制手段應(yīng)用于食品工業(yè)中C. sakazakii生物膜的防控。

2. 生物膜形成機(jī)制

“防勝于治”，因此，生物膜形成機(jī)制的深入研究將對食品生產(chǎn)環(huán)境的設(shè)計(jì)及生物膜防控具有重要意義。生物膜是一種可在各種表面形成，由不同生物聚合物組成的胞外基質(zhì)所包裹的復(fù)雜微生物群集[25]。通過掃描電鏡（scanning electron microscopy, SEM）和激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy, CLSM）等手段對C. sakazakii生物膜的形成過程進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)從附著、成熟、擴(kuò)散到下一輪附著的一系列動(dòng)態(tài)過程。起初，浮游細(xì)菌附著在載體表面并分泌大量的胞外聚合物。隨著細(xì)胞的生長，細(xì)菌聚集在一起形成增厚的生物膜，且在72 h時(shí)，生物膜的生長達(dá)到最大值。而當(dāng)生長到96 h時(shí)，生物膜已脫離介質(zhì)表面并釋放細(xì)菌（圖1）。由此可見，C. sakazakii生物膜的整體形成過程與其他細(xì)菌相似[34]。該菌擁有多種能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通信的分子機(jī)制，將細(xì)胞附著在非生物表面并成長為有彈性的結(jié)構(gòu)，從而形成生物膜。

2.1. 影響C. sakazakii 生物膜發(fā)育的環(huán)境因素

2.1.1. 培養(yǎng)條件

圖1. 不同物質(zhì)對生物膜形成的抑制作用。（a）生物膜形成的動(dòng)態(tài)過程，包括附著、成熟、擴(kuò)散和下一輪附著；周期過程通常包括6個(gè)步驟，如圖所示。（b）物質(zhì)在生物膜形成的不同步驟中的去除作用，如掃描電鏡圖像（×2500）所示。生物膜用碘化丙啶和SYTO9染色，CLSM觀察。

生物膜的形成是一個(gè)受環(huán)境變化影響的復(fù)雜過程。C. sakazakii生物膜形成能力和胞外多糖（extracellular polymeric substances, EPS）的分泌因環(huán)境條件的不同而改變，包括接觸面性質(zhì)、營養(yǎng)有效性和相對濕度[35]。Ye等[36]對23株C. sakazakii在不同孵育時(shí)間、pH值、溫度條件下生物膜形成能力進(jìn)行評估。結(jié)果表明，生物膜形成過程中多糖的生物量和性質(zhì)呈現(xiàn)菌株特異性，并受其培養(yǎng)微環(huán)境的影響。在乳制品生產(chǎn)過程中，生物膜的生長可能也與EPS和牛奶殘?jiān)ㄖ饕堑鞍踪|(zhì)和磷酸鈣）有關(guān)。牛奶成分也影響Cronobacter生物膜的形成。脫脂乳中乳清蛋白和酪蛋白比乳糖對Cronobacter生物膜形成的影響更大，且氮源對其的影響大于碳水化合物[37]。此外，Ye等[38]還比較了Ca2+和Mg2+對從PIF分離的C. sakazakii生物膜的影響。結(jié)果顯示，二價(jià)陽離子濃度對生物膜總生物量有一定的影響，1.50% MgCl2和0.25% CaCl2為其最佳生長條件。并且，二價(jià)陽離子還能改變細(xì)胞外基質(zhì)的生物量特性。

2.1.2. 接觸表面

接觸面是生物膜形成的先決條件之一。接觸表面的性質(zhì)將影響細(xì)胞黏附和隨后生物膜的形成。當(dāng)細(xì)胞接觸和黏附介質(zhì)時(shí)，這兩種物質(zhì)之間可以建立靜電相互作用。由于大多數(shù)細(xì)菌表面都帶負(fù)電荷，所以帶正電荷的接觸表面將有利于生物膜的形成[39]。然而，在實(shí)際情況下，接觸面也可能暴露在由離子和小分子組成的高離子介質(zhì)中，這些離子和小分子通過擴(kuò)散和傳質(zhì)過程吸附在接觸面上，從而改變接觸面性質(zhì)。接觸面和細(xì)菌細(xì)胞之間的相互作用也隨之被改變，并建立起靜電相互作用。當(dāng)微生物細(xì)胞通過靜電相互作用吸附到表面時(shí)，細(xì)胞與接觸面之間的距離縮短。

當(dāng)接觸面的非極性和低表面能疏水基團(tuán)與細(xì)菌細(xì)胞相互作用后，由于接觸界面的疏水性有改變的趨勢，細(xì)胞在表面的黏附能力也受此改變[40,41]。Davidson和Lowe [42]發(fā)現(xiàn)接觸表面的疏水基團(tuán)有利于生物膜的形成和穩(wěn)定。然而，Heistad等[43]卻給出了不同的觀點(diǎn)，他認(rèn)為界面疏水性與生物膜的形成沒有明顯的關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)，與不銹鋼相比，C. sakazakii細(xì)胞更容易附著在硅膠和聚碳酸酯上（P<0.05），且親水性材料似乎更有利于C. sakazakii生物膜的形成[29]。因此，C. sakazakii生物膜形成與界面疏水性之間是否存在關(guān)聯(lián)性是一個(gè)具有爭議的問題，對該菌的黏附性仍需更多的研究去確證其相關(guān)性。

此外，表面粗糙度可降低液體流動(dòng)相中細(xì)胞的水力剪切力。因此，表面粗糙度將保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞不被水流清除，并增強(qiáng)細(xì)胞的初始黏附力。然而，不同細(xì)菌的細(xì)胞顆粒大小存在較大差異，從而會導(dǎo)致不同細(xì)菌的最佳接觸表面粗糙度。

2.2. 細(xì)胞自我調(diào)節(jié)

2.2.1. 群體感應(yīng)

在大多數(shù)環(huán)境中，生物膜以混合種群而非單一物種的形式存在。這種生存模式賦予其具有區(qū)別單一物種的特有生理功能。生物膜內(nèi)物種的種間調(diào)節(jié)機(jī)制主要是群體感應(yīng)（quorum sensing, QS）[44,45]。這種QS系統(tǒng)會產(chǎn)生一種稱為“自誘導(dǎo)物”（autoinducer, AI）的低分子量信號分子，它根據(jù)周圍環(huán)境中的細(xì)菌數(shù)量啟動(dòng)自身表達(dá)[46]。當(dāng)生物膜中的細(xì)菌數(shù)量增長到一個(gè)感應(yīng)閾值濃度時(shí)，細(xì)菌釋放信號分子用以改變和協(xié)調(diào)其生理活動(dòng)。QS系統(tǒng)監(jiān)管細(xì)菌中營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝終產(chǎn)物的去除等相關(guān)基因表達(dá)的變化。這種調(diào)控行為可以降低由于細(xì)菌過度生長而導(dǎo)致的空間和營養(yǎng)的缺乏，從而促進(jìn)生物膜的形成。

革蘭氏陰性細(xì)菌主要利用N-?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl-L-homoserine lactones, AHL）進(jìn)行相互交流，而這些細(xì)菌傳遞信息的物質(zhì)通常是幾種AHL的混合物（圖2）。群體感應(yīng)通路通常包含兩個(gè)重要的蛋白質(zhì)（LuxI和LuxR），它們分別在自誘導(dǎo)物的合成和識別中起關(guān)鍵作用。LuxI是一種可以在細(xì)胞內(nèi)外自由擴(kuò)散，誘導(dǎo)合成QS自誘導(dǎo)物AHL及其衍生物的合成酶。隨著細(xì)菌密度的增加，當(dāng)AHL濃度達(dá)到臨界值時(shí)，AHL與LuxR結(jié)合，并激活下游基因的表達(dá)，從而改變其對周圍環(huán)境的生理反應(yīng)[47]。AHL一般由一個(gè)含4～18個(gè)碳的乙?；溛膊颗c一個(gè)保守的高絲氨酸內(nèi)酯頭部組成，其主要區(qū)別取決于?；鶄?cè)鏈的長度、飽和度及C3位的取代基[48]。目前，已有研究表明C. sakazakii可分泌3種信號分子（N-庚烷基-AHL、N-十二烷基-AHL和N-十四烷基-AHL）[49]。Lehner等[30]表示Cronobacter可通過表達(dá)群體感應(yīng)信號分子AHL調(diào)控生物膜的形成，并用薄層色譜法發(fā)現(xiàn)了兩種不同類型的AHL——3-oxo-C6-AHL和3-oxo-C8-AHL。研究者采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)檢測AHL，結(jié)果表明C6～C18長鏈AHL的表達(dá)顯著。此外，液相色譜-高分辨率質(zhì)譜儀也在C. sakazakii成膜菌株中鑒定到N-十一烷基-L-AHL、N-十二烷基-L-AHL、N-十四烷基-L-AHL、N-十五烷基-L-AHL、N-（β-乙酰酮）-L-AHL、N-辛?；?L-AHL、N-3-oxo-辛?；?LAHL和N-十八?；?L-AHL的存在[50]。

未來更多的研究應(yīng)該集中在QS系統(tǒng)介導(dǎo)的C. sakazakii生物膜形成和發(fā)展調(diào)控機(jī)制研究。這將為探索基于QS控制致病菌生物膜提供新策略。

2.2.2. 細(xì)胞的遺傳元素和理化性質(zhì)

生物膜中的微生物被其胞外高分子基質(zhì)所包裹。胞外多聚物（extracellular polymeric substance, EPS）主要由細(xì)胞外多糖、蛋白質(zhì)及細(xì)胞外DNA和基質(zhì)組成，且該基質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞在介質(zhì)表面的黏附和細(xì)胞的集結(jié)（圖3）。這些基質(zhì)填充了細(xì)菌之間的空隙，構(gòu)成良好的機(jī)械穩(wěn)定性。由于這種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，生物膜中的微生物獲得很高的存活率和持久性。不同胞外聚合物組分的濃度、黏性、電荷和吸收能力，以及基質(zhì)的密度、孔徑和通道都決定了生物膜的異質(zhì)性。因此，生物膜會呈現(xiàn)出各種形態(tài)學(xué)特征，如光滑、扁平、粗糙、蓬松或絲狀，甚至形成像蘑菇狀的水包圍的團(tuán)塊[28]。

圖2. 革蘭氏陰性菌中AHL介導(dǎo)QS的簡化圖。革蘭氏陰性菌具有兩種調(diào)節(jié)成分：LuxI和LuxR。LuxI是AHL生物合成所必需的，LuxR編碼AHL結(jié)合蛋白。一旦達(dá)到閾值濃度，AHL將自由進(jìn)入鄰近細(xì)胞。由LuxR和AHL組成的復(fù)合物將激活下游基因的表達(dá)。生物膜的形成隨后受到AHL介導(dǎo)的QS調(diào)控的靶基因的影響。

圖3. 革蘭氏陰性菌生物膜的基本成分。

最近，研究人員通過比較蛋白組方法研究了Cronobacter的生物膜相和浮游相的差異蛋白，并證實(shí)了其差異表達(dá)蛋白大多富集在鞭毛、纖維素合成、氨基酸代謝和碳水化合物的代謝途徑中[51?53]。Cronobacter莢膜由O抗原、K抗原、膽汁酸、纖維素和腸道菌共性抗原組成。這些組分的比例可能會隨著生長條件的變化而變化，但目前還沒有關(guān)于Cronobacter莢膜的研究。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，特定的莢膜型別與新生兒腦膜炎病例有一定的關(guān)聯(lián)性，因此這一領(lǐng)域需要被更多的關(guān)注[54]。此外，細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素通常是細(xì)胞外的一種成分，它能給細(xì)胞提供機(jī)械和化學(xué)保護(hù)以抵御不利環(huán)境。纖維素也是生物膜的一個(gè)結(jié)構(gòu)成分，它形成了具有強(qiáng)水吸附能力的水凝膠。纖維素是由BcsA和BcsB組成的纖維素合成酶復(fù)合物合成和分泌的。其中，bcsA編碼纖維素合成酶催化亞單位，bcsB編碼磷酸鳥苷環(huán)二聚體（cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP）結(jié)合蛋白。纖維素的生物合成和調(diào)控需要兩個(gè)遺傳元件，分別為bcsABZC和bcsEFG操作子（圖4）。由9個(gè)基因（bcsGFERQABZC）組成的纖維素基因簇幾乎在所有的C. sakazakii菌株中都存在[54]。Hu等[55]對臨床、食品和環(huán)境中分離出的菌株中纖維素合成酶相關(guān)基因的分布情況進(jìn)行比較。結(jié)果表明，所有臨床分離株中和大部分的食品、環(huán)境分離株可檢出纖維素合成酶操縱子（bcsABZC）。此外，與親代菌株相比，bcsA和bcsB的缺失會導(dǎo)致生物膜形成能力和細(xì)胞凝集力顯著降低，并且bcsA和bcsB突變體不產(chǎn)生纖維素。BcsR對C. sakazakii纖維素合成有負(fù)調(diào)控作用，但對其生物膜形成、黏附和侵襲均有正調(diào)控作用。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）也驗(yàn)證了在ΔbcsR突變株中纖維素合成關(guān)鍵基因（bcsA,B,C,E,Q）比野生株表達(dá)上調(diào)及鞭毛合成基因（fliA,C,D）、毒理基因（ompA,ompX,hfq）表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。這些基因中，ΔbcsR突變株中fliC和ompA表達(dá)量下調(diào)更顯著。同時(shí)，研究者又通過拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)，在bcsR敲除后，類胡蘿卜素、脂肪酸和酰胺等生物膜成分也顯著降低[56]。

此外，細(xì)菌胞外細(xì)胞器（鞭毛、纖毛、菌毛等）有助于克服靜電排斥并增強(qiáng)載體界面上的細(xì)菌積累[57]。通過對Cronobacter比較基因組分析，確定了10個(gè)假定的菌毛基因簇[58]。特別的是，編碼β-菌毛的基因簇是C. sakazakii特有的，而其他6個(gè)菌種的基因組編碼卷曲菌毛。卷曲纖維是一種薄的、卷曲的、高度聚集的淀粉樣纖維無定形的基質(zhì)。它們參與了細(xì)胞褶皺、聚集、黏附、生物膜形成和環(huán)境持留[59]。由于C. sakazakii感染途徑可能是通過腸道細(xì)胞的附著和侵襲，所以該菌菌毛除了對生物膜的形成具有重要意義外，其在致病性方面也具有深遠(yuǎn)影響。Hartmann等[60]也同樣發(fā)現(xiàn)，在其研究的C. sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株中卷曲菌毛相關(guān)的基因也出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。由于C. sakazakii是該屬臨床分離株的優(yōu)勢菌種，因此可以推斷卷曲菌毛并非Cronobacter致病所必須的細(xì)胞器官。卷曲菌毛可與纖維素一起形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)生物膜的構(gòu)建[61]。卷曲菌毛的生物合成和組裝分別由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄操作子csgDEFG和csgBA編碼。csgBA操作子編碼卷曲結(jié)構(gòu)主要的亞單位CsgA和細(xì)胞核蛋白CsgB [62]。Hu [63]在180株C. sakazakii中檢測與此纖維合成相關(guān)的遺傳元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有的C.sakazakii菌株中均無csgA和csgG基因。此外，csgBAC和csgDEFG操作子在C. sakazakii菌株中也是缺失存在。盡管如此，csgA和csgB對除了C. sakazakii和C.muytjen-sii之外的Cronobacter其他菌種的卷曲菌毛、生物膜形成和細(xì)胞聚集都有積極的調(diào)控作用。因此，C. sakazakii可能通過表達(dá)其他途徑中的不同蛋白質(zhì)調(diào)控生物膜形成和細(xì)胞聚集，使其產(chǎn)生與卷曲菌毛相似的生理功能。

圖4. 阪崎克羅諾桿菌生物膜形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[58?66]。

運(yùn)動(dòng)性通常能賦予細(xì)胞具有從附著表面駛向更適合生長區(qū)域的能力，而運(yùn)動(dòng)力往往被認(rèn)為與生物膜的形成密切相關(guān)[64]。浮游態(tài)細(xì)胞因其有旋轉(zhuǎn)鞭毛而具有運(yùn)動(dòng)性能（圖4）。FlhA和FliG蛋白構(gòu)成了鞭毛基體，而FlhA的缺失會導(dǎo)致鞭毛成分的缺失。FliG與FliN和FliM一起構(gòu)成基體的C環(huán)[65]。位于鞭毛基部的發(fā)動(dòng)機(jī)（MotA和MotB蛋白）利用質(zhì)子動(dòng)力加強(qiáng)螺旋纖維的旋轉(zhuǎn)以推動(dòng)細(xì)胞至不同的環(huán)境[66]。ΔflhA、ΔfliG、ΔfliC和ΔflaAΔfliC突變株細(xì)胞無鞭毛并喪失自凝能力，相反地，ΔmotAB和ΔflaA突變株仍保留鞭毛結(jié)構(gòu)和自凝性。ΔflaA具有運(yùn)動(dòng)性，而ΔmotAB已不具有運(yùn)動(dòng)性。另外，F(xiàn)liC并非介導(dǎo)了C. sakazakii在PVC上的成膜性。研究人員認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)性和基質(zhì)合成通常是相反的，且同步地被調(diào)控。然而，通過對C. sakazakii鞭毛缺失突變體和一些調(diào)控基因的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性與生物膜之間的關(guān)系是具有菌株特異性的。此外，鞭毛是否對生物膜的形成有積極或消極作用的論題仍存在爭議，而非動(dòng)力因素也可能影響生物膜的發(fā)育[67]。

近些年，高通量的功能基因組學(xué)得到了長足發(fā)展，微生物種群的研究范圍大大提升。高分辨率的DNA測序技術(shù)對于探索不同環(huán)境的微生物群落組成和功能具有重要的價(jià)值[68]。代謝組學(xué)是一個(gè)不斷發(fā)展的研究領(lǐng)域，它不僅可以發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記還能夠更好地揭示表型形成機(jī)制[69]。多組學(xué)數(shù)據(jù)技術(shù)（如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)）的聯(lián)合應(yīng)用可以系統(tǒng)性地捕捉微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能輪廓。由于信息學(xué)和分析技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，“多組學(xué)”方法將為微生物生理學(xué)提供新的見解[70]。目前，大型組學(xué)數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析可以應(yīng)用于揭示與表型特征相關(guān)的調(diào)控途徑及關(guān)鍵靶標(biāo)。隨后，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)直接改變特定的DNA區(qū)域，即可驗(yàn)證這些變化對生理現(xiàn)象的影響。因此，這些技術(shù)將有助于加深理解細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制，包括它們的形成和分散過程（圖5）。

3. 生物膜的清除與防控

Cronobacter可以從各種惰性和生物活性表面分離得到，并在食品工業(yè)中廣泛存在[24,71?73]。據(jù)報(bào)道，這種細(xì)菌可以從生產(chǎn)環(huán)境中檢出，且特定的菌株可以在工廠里存活幾個(gè)月，甚至幾年。由于人們常用PIF和幼兒奶粉（follow-up-formula, FUF）喂養(yǎng)嬰幼兒，因此降低這些奶粉中的Cronobacter污染已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[20]。一般情況下，PIF喂養(yǎng)不超過12個(gè)月大的嬰兒；FUF是6個(gè)月以上的嬰兒和12個(gè)月以上至3歲的幼兒的斷奶食品[74,75]。這類產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中會經(jīng)過高溫和干燥處理環(huán)節(jié)，這些處理有助于保障產(chǎn)品的微生物安全[76,77]。然而，在儲存和包裝的后處理過程中，如滾筒干燥機(jī)、包裝機(jī)、干燥塔和空氣過濾器這些設(shè)備也會受到C. sakazakii的污染（圖6）。因此，在生產(chǎn)過程中細(xì)菌的生存將受到各種各樣的挑戰(zhàn)。生物膜的形成是細(xì)菌抵御外界應(yīng)力的重要策略，生物膜對其的保護(hù)作用不容忽視。研究表明，生物膜態(tài)的Cronobacter細(xì)胞比浮游態(tài)細(xì)胞對清潔劑和消毒劑具有更高的耐藥性，這就是個(gè)很好的證據(jù)[78]。目前，控制和消除乳制品/食品加工設(shè)備中的生物膜仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。

3.1.原位清洗系統(tǒng)

在食品生產(chǎn)過程中，清潔是減輕微生物附著在接觸面上的一個(gè)極其重要的過程。目前，原位清洗（clean in place, CIP）系統(tǒng)已逐步取代人工清洗。在此系統(tǒng)中，生產(chǎn)設(shè)備無需拆卸即可進(jìn)行自動(dòng)或半自動(dòng)清洗，洗滌劑溶液通過壓力或質(zhì)量流量噴到設(shè)備上。這種方法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)工廠的各個(gè)階段[79]。

Bremer等[80]研究了CIP在乳品工業(yè)中去除不銹鋼表面生物膜的效果。他們提出，標(biāo)準(zhǔn)CIP系統(tǒng)并非總能確保細(xì)菌生物膜的去除，而改變CIP條件可以增強(qiáng)乳品加工廠內(nèi)生物膜的去除。影響CIP清潔效果的因素有清洗溫度、時(shí)間、化學(xué)成分、濃度、表面特性和生物膜層[81?83]。Kumari和Sarkar [84]在實(shí)驗(yàn)室模擬蠟樣芽孢桿菌在乳制品冷藏槽中形成生物膜，以優(yōu)化其CIP體系。標(biāo)準(zhǔn)CIP可達(dá)到每平方厘米3.29 log的減少量，而通過改變藥劑濃度和CIP工藝處理時(shí)間得到優(yōu)化后的CIP將達(dá)到每平方厘米4.77 log的清除量。優(yōu)化CIP系統(tǒng)不僅可以提高食品安全，而且還可改善產(chǎn)品質(zhì)量、設(shè)備性能，并具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。然而，目前對于控制乳業(yè)中C.sakazakii生物膜的CIP優(yōu)化體系還知之甚少。

3.2. 物理處理

圖5. 生物膜研究中的多種組學(xué)方法。GWAS：全基因組關(guān)聯(lián)分析；MWAS：宏基因組關(guān)聯(lián)性分析；RNA-seq：RNA測序（包括mRNA、小RNA、lncRNA和circRNA）；ChIP-seq：染色質(zhì)免疫沉淀測序；iTRAQ：同位素標(biāo)記相對和絕對定量；SWATH：按窗口順序采集所有理論質(zhì)譜譜圖。

圖6. 生物膜的常見定殖區(qū)和在PIF加工過程中潛在的生物膜處理方法。i. 涂層；ii. 益生元產(chǎn)品；iii. 噬菌體；iv. 天然提取物（包括基于天然提取物的信號阻斷）；v. 超聲波清洗；vi. 基于納米技術(shù)的遞送系統(tǒng)；vii. 消毒劑。

通常，用于去除細(xì)菌生物膜的物理方法包括機(jī)械法、超聲波法和電學(xué)法。設(shè)備的設(shè)計(jì)和表面材料的選擇對防止生物膜的形成起著關(guān)鍵的作用。目前，銅合金廣泛應(yīng)用于食品加工工業(yè)中，其對細(xì)菌（尤其是抗銅離子的細(xì)菌）具有抑制作用[85]。銅合金可以從表面釋放銅離子，改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致銅進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而損傷鐵硫蛋白[86]。Elguindi等[87]發(fā)現(xiàn)，懸浮于胰酶大豆肉湯中的C. sakazakii細(xì)胞在濕的99.9%銅合金上會在10 min內(nèi)被殺死，且在干燥的99.9%銅合金上1 min內(nèi)得以死亡。結(jié)果表明，在食品加工干燥過程中應(yīng)用銅可以有效地在包裝前、包裝中及包裝后的儲存中殺滅C.sakazakii。

Cronobacter對干燥具有高度耐受能力，能在PIF中存活兩年以上[88]。然而，它不是產(chǎn)孢菌，因此對熱脅迫并未有較強(qiáng)的抵抗力[89]。Nazarowec-White和Farber [90]測定了一個(gè)含有10株克羅諾桿菌（5株臨床分離株和5株食品分離株）混池的D值。結(jié)果顯示，該混池52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃和60 ℃的D值分別為54.8 min、23.7 min、10.3 min、4.2 min和2.5 min；z值為5.82 ℃。此外，Iversen等[91]比較了Cronobacter標(biāo)準(zhǔn)菌株和莢膜菌株的耐熱性。但由于結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差較大，所以標(biāo)準(zhǔn)菌株和莢膜菌株的D值和z值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究者還測定了54 ～ 62 ℃下PIF中懸浮細(xì)胞的D值。54 ℃時(shí)D值為10.2 ～ 16.4 min，62 ℃時(shí)D值為0.2 ～ 0.4 min；z值 為5.7 ℃。Awadallah等[92]發(fā) 現(xiàn)，Cronobacter菌株具有耐熱性，在64 ℃下該菌的D值為13.79 min；z值為14.42 ℃。而Ueda [93]則發(fā)現(xiàn)，60 ℃以上Cronobacter菌株可在2 ～ 5 min內(nèi)完全失活。因此，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（The Food and Agriculture Organization, FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）提出，PIF應(yīng)在>70 ℃的溫度下沖泡，并在殘留菌株繁殖到顯著水平之前立即使用[78]。然而，在食品加工過程中，熱休克往往可能會誘導(dǎo)細(xì)菌的保護(hù)機(jī)制，使機(jī)體能夠在噴霧干燥處理后存活[94]。

CIP常采用的另一種消毒方法是電磁波輻射。電磁波法是通過破壞或改變生物大分子的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)細(xì)菌失活的方法。Mahmoud [95]研究X射線照射Cronobacter后該菌的生存能力變化。結(jié)果表明，5.0 kGy的X射線處理后，Cronobacter在脫脂牛奶和含有1%脂肪的奶粉中存活率均顯著（P< 0.05）降低至檢測限以下（<1 log CFU·mL–1）。此外，紫外線（UV-C）（200～280 nm）、酸性電解水和中性電解水在微生物控制中應(yīng)用也較多，其中，UV-C光照對C. sakazakii的殺滅效果更好。使用7.5 kJ·m–2和10 kJ·m–2劑量的UV-C后，活菌數(shù)分別減少2 log CFU·g–1和2.4 log CFU·g–1[96]。近紅外（near-infrared, NIR）加熱與紫外輻射聯(lián)合處理C. sakazakii7 min后表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同殺菌能力，菌體CFU降低2.79-logunit，這種協(xié)同作用主要破壞細(xì)菌細(xì)胞膜[97]。盡管在乳制品工業(yè)中，輻照是一種有效和安全的去除C. sakazakii的替代技術(shù)，但維生素和脂類物質(zhì)對輻照很敏感，輻照可能會導(dǎo)致維生素和脂類的減少，從而導(dǎo)致營養(yǎng)成分的損失。食物種類、輻照劑量、溫度、含氧量、維生素種類等都會對輻照后的維生素?fù)p失產(chǎn)生不同程度的影響。從營養(yǎng)的最大化和食品安全與健康平衡的角度出發(fā)，我們需要開發(fā)和改進(jìn)更為先進(jìn)的綠色殺菌技術(shù)。

與傳統(tǒng)的擦拭方法相比，超聲是一種更有效的生物膜去除方法[98]。然而，單獨(dú)應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)不能完全消滅細(xì)菌，因此多種方法的聯(lián)合使用應(yīng)運(yùn)而生。Adekunte等[99]對接種C. sakazakii的PIF在高溫和超聲協(xié)同作用下進(jìn)行細(xì)菌滅活性比較，結(jié)果表明，兩者聯(lián)合使用可顯著降低C. sakazakii的活性。壓力超聲波（manosonication, MS）是在壓力下進(jìn)行超聲波，其通過空化強(qiáng)度對細(xì)菌起到致死作用。C. sakazakii在標(biāo)準(zhǔn)處理下（35 ℃，117 μm，200 kPa，磷酸檸檬酸緩沖液pH 7.0）的D值是0.41 min，這個(gè)結(jié)果高于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（D=0.19 min），并低于腸炎沙門氏菌（D= 0.61 min）、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（D= 0.86 min）和屎腸球菌（D= 1.2 min）[100]。

物理處理無疑是主要的生物膜控制策略之一，但它可能無法完全去除生物膜，并且不適用于食品加工的所有階段。因此，需要化學(xué)或生物控制方法來補(bǔ)充或配合物理處理。

3.3.化學(xué)處理

3.3.1.殺菌劑

對高效、安全的抗菌物質(zhì)的研發(fā)往往希望效益高、對環(huán)境無污染、無殘留、經(jīng)濟(jì)效益高。Kim等[78]比較了13種消毒劑處理后，Cronobacter在懸浮液和不銹鋼表面干燥的生物膜中的存活情況。這些消毒劑的選擇參考其在醫(yī)院、日托中心和食品服務(wù)廚房的使用情況。季銨鹽類化合物和過氧乙酸/過氧化氫相關(guān)消毒劑對Cronobacter生物膜的殺滅效果較好。在濃度為400 mg·L–1的苯扎氯銨、過氧乙酸和二氧化氯15 min處理?xiàng)l件下，活菌數(shù)分別減少了69%、73%和51%。然而，使用結(jié)晶紫測定生物膜量時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些處理僅對18%的生物膜生物量產(chǎn)生抑制作用[101]。雖然這些殺菌劑在食品安全中發(fā)揮著重要作用，但值得注意的是，過量使用殺菌劑可能會產(chǎn)生耐藥性菌株，從而對臨床重要藥物產(chǎn)生交叉耐藥[102]。目前，細(xì)菌耐藥性是一個(gè)全球共性問題，它制約著臨床治療的有效性。

3.3.2. 植物提取物

傳統(tǒng)的消毒方法對生物膜并非完全有效，反而可能會誘導(dǎo)抗性表型的改變。因此，有必要進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用無化學(xué)殘留的綠色（或生態(tài)友好型）殺菌劑。目前，很多研究正在評估從植物中提取的天然化合物在消除生物膜方面的潛力。這些天然化合物具有穿透細(xì)菌生物膜的能力，在環(huán)境中很容易降解，而且?guī)缀鯚o毒。

反式肉桂醛（trans-cinnamaldehyde, TC）是從肉桂皮提取的一種成分，也是肉桂油的原料，它是美國食品和藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)的食品級物質(zhì)。Amalaradjou和Venkitanarayanan [103]研究了TC對附著在聚苯乙烯板、不銹鋼片、哺乳瓶片、腸內(nèi)給料管片表面上的生物膜的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TC可以滅活附著在以上所有檢測基質(zhì)上的C. sakazakii生物膜。當(dāng)C. sakazakii在38 mmol·L–1和750 μmol·L–1TC中處理96 h后，其存活量分別減少了超過4.0 log CFU·mL–1和3.0 log CFU·mL–1。此外，TC還能顯著抑制C. sakazakii生物膜和毒力相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因?qū)ζ浠盍?、宿主組織的黏附和侵襲、巨噬細(xì)胞的存活以及脂多糖的合成至關(guān)重要。因此，TC處理后，C. sakazakii對腸上皮細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和侵襲受到明顯抑制（P≤0.05），并且其在人巨噬細(xì)胞中存活率也有所降低，并降低C. sakazakii自身的存活[104]。

多酚對人體健康非常有益，可以增強(qiáng)血管壁、促進(jìn)胃腸消化、降低血脂、抑制細(xì)菌和癌細(xì)胞的增殖，并具有抗氧化活性可以清除對人體健康有害的自由基。近期，已證明圓葉葡萄種子提取物對Cronobacter具有一個(gè)高水平的殺滅能力，其在1 h可將大約6 log CFU·mL–1的原始菌量降低到無法檢測的水平（最低檢出限，10 CFU·mL–1）。極性酚和多酚可能為圓葉葡萄種子提取物的主要抗菌成分[105]。藍(lán)莓汁和藍(lán)莓多酚也可抑制C.sakazakii。分別用藍(lán)莓汁（pH 2.8）或藍(lán)莓原花青素處理C.sakazakii1 h，菌量從大約8.30 log CFU·mL–1降至無法檢測的水平[106]。

3.3.3. 抗菌肽

抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）是一種天然免疫系統(tǒng)分子，并作為抵抗病原體入侵的第一道防線。這些天然蛋白廣泛存在于包括動(dòng)物、植物、昆蟲和細(xì)菌的各種生物體中[107]。天然AMP通常比較短，由12～100個(gè)氨基酸組成。AMP基于其二級結(jié)構(gòu)可以分為4種類型：β折疊、α螺旋、環(huán)狀和伸展性肽，其中前兩類是自然界中最常見的[108]?；瘜W(xué)防腐劑的過度使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而傳統(tǒng)的食品保鮮方法已不能滿足食品安全的要求。近年來，AMP作為天然生物防腐劑被應(yīng)用于提高食品的貨架期[109]。許多研究人員表示，AMP可對多種食源性致病菌均表現(xiàn)出抑制作用，且不改變其食物特性，并對人體無危害性[110]。在解決細(xì)菌生物膜引起的持續(xù)污染研究中，AMP被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的潛在替代品。AMP能在生物膜形成的不同形成階段與其對抗[111]。細(xì)菌的清除是由于抗菌肽的滲透或其在細(xì)胞膜表面形成小孔來實(shí)現(xiàn)的[112]。此外，AMP還能抑制細(xì)胞壁、核酸和蛋白質(zhì)的生物合成。人類抗菌肽LL-37能夠破壞表皮葡萄球菌生物膜的發(fā)育。LL-37顯著降低細(xì)菌對表面的附著，且該抗菌肽在不能殺死或抑制其浮游細(xì)菌生長的濃度下也能顯著減少其生物膜量，說明肽對生物膜產(chǎn)生了直接作用[113]。除此之外，AMP還被認(rèn)為促發(fā)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，并下調(diào)生物膜發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[114]。

許多天然、半合成和合成的AMP已被證明均對微生物生物膜具有抗性。生物膜有效AMP (biofilm-active AMP, BaAMP)是一個(gè)收集了針對微生物生物膜有作用的AMP數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫中的AMP可為生物膜形成過程的干預(yù)提供參考。靶向Cronobacter生物膜的AMP的優(yōu)化以及發(fā)掘和合成新的肽段是非常必要的。BaAMP可以通過http://www.baamps.it免費(fèi)訪問。AMP的設(shè)計(jì)方法有很多，但合成抗菌肽在食品中的應(yīng)用必須注意該物質(zhì)的食用安全性。

3.4.生物過程

微生物多種種間相互作用和產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會干擾生物膜的形成和發(fā)育。下面討論兩種最常用的通過微生物-微生物相互作用來消滅細(xì)菌及其衍生物的方法。

3.4.1. 益生菌產(chǎn)品

克非爾（kefir）是一種對C. sakazakii具有抗菌活性的益生菌乳制品[115]。從kefir中分離的乳酸菌上清液中發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus kefiriDH5和L.kefiranofaciensDH101這兩種菌株對C.sakazakiiATCC 29544的增殖有明顯的抑制作用。L.kefiriDH5可破壞C.sakazakii的細(xì)胞膜完整性，因此其對該菌具有較高的滅活性。Awaisheh等[116]研究了乳酸菌對不同C. sakazakii的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)從健康嬰兒中分離的益生乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素可以抑制C.sakazakii。然而，這些細(xì)菌素由于其低耐熱性而不能用于工業(yè)生產(chǎn)中。因此，在PIF中添加益生菌產(chǎn)品不僅能促進(jìn)嬰幼兒的健康成長，還能抑預(yù)防C.sakazakii的潛在污染。

3.4.2. 噬菌體

利用噬菌體來控制生物膜是一種可行的、自然的、無害的、特異的方法[117]。例如，QS信號分子AI-2的加入可以誘導(dǎo)原噬菌體，并促進(jìn)了糞腸桿菌生物膜中的細(xì)菌解散[118]。ListShield (Intralytix, Inc., USA)是于2006年由FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于食品安全的噬菌體產(chǎn)品，從而確認(rèn)噬菌體可作為一種食品中的安全添加劑[119]。至此以后，越來越多的噬菌體產(chǎn)品被批準(zhǔn)作為食品微生物控制劑。這些進(jìn)展突出了噬菌體在控制食源性致病菌和腐敗微生物方面的潛力。與傳統(tǒng)抗生素治療相比，噬菌體相關(guān)的控制方法具有以下優(yōu)點(diǎn)。

（1）安全性高：特異性噬菌體不會感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

（2）易獲?。菏删w在環(huán)境中普遍存在，因此相對容易獲取。

（3）特異性強(qiáng)：靶向致病菌的特異性噬菌體將不干擾人體其他正常菌群和食物基質(zhì)固有菌群。

為了保證PIF的安全性，雀巢公司提出了一種無毒的溶菌噬菌體，以減少Cronobacter的污染[120]。Endersen等[121]的研究發(fā)現(xiàn)，其測試的噬菌體雞尾酒的宿主范圍相對較廣，覆蓋了研究中73%C.sakazakii菌株。噬菌體混合（3×108CFU·mL–1）可顯著降低C.sakazakii存活率，使其從≤104CFU·mL–1降至低于檢測限（<10 CFU·mL–1）。當(dāng)細(xì)菌在噬菌體雞尾酒處理48 h后，其生物膜的形成也受到了抑制。由于噬菌體可在4 ～37 ℃、pH值范圍為6 ～ 8的條件下增殖，且所有噬菌體都不具有溶原性，因此這些噬菌體具有潛在治療應(yīng)用價(jià)值。這些研究均表明噬菌體在PIF中C.sakazakii污染的生物控制以及預(yù)防該菌生物膜形成方面的潛在應(yīng)用。

3.5. 潛在方法

3.5.1. 納米技術(shù)

近些年，納米材料及其技術(shù)的快速發(fā)展為開發(fā)控制微生物生物膜的抗菌劑提供了新策略[122]。納米銀、二氧化鈦、氧化銅等納米材料都具有良好的抗菌活性[123,124]。這些納米粒子具有高穩(wěn)定性、殺菌劑耐受性、低毒、比表面積高等特性，這些特性賦予納米粒子具有與細(xì)菌相互作用更有效的位點(diǎn)。這些材料作為設(shè)備涂層可以有效地控制食品加工過程中細(xì)菌的生長。

基于納米技術(shù)的傳遞系統(tǒng)也是增強(qiáng)材料抗生物膜活性的重要手段。針對生物膜的殺菌劑效果通常由于其無法很好地滲透進(jìn)生物膜基質(zhì)而受到限制。然而，基于納米技術(shù)的藥物傳遞系統(tǒng)可以使納米顆粒和微生物膜相互作用，進(jìn)而藥物直接作用生物膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。目前，用于傳遞生物活性物質(zhì)的納米載體主要有脂質(zhì)體（liposome, LIP）、微乳液、納米乳液、環(huán)糊精、固體脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒和金屬納米顆粒[125]。Robinson等[126]比較了帶有陽離子和陰離子的LIP負(fù)載疏水性殺菌劑三氯生（triclosan, TCS）對殺菌效果的影響，TCS是一種高效的烯酰-ACP還原酶抑制劑。陰離子脂質(zhì)體對S.sanguis純菌生物膜有較強(qiáng)的傳遞殺菌物質(zhì)的效果，且該脂質(zhì)體-三氯生體系具有更高的殺菌效果。而陽離子脂質(zhì)體-三氯生傳遞系統(tǒng)只能抑制S.sanguisC104生物膜的生長，對混合菌群的生物膜無明顯抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)證明了靜電相互作用對抗菌劑傳遞的重要性。

納米酶被定義為具有類酶活性的納米材料，可以在生理?xiàng)l件下催化天然酶底物產(chǎn)生類似的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為[127]。這些材料基于納米酶中氧化酶和過氧化物酶的活性能夠催化產(chǎn)生自由基，破壞細(xì)胞膜的完整性，降解核酸，使各種蛋白質(zhì)失活，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，天然酶的天然催化活性很容易受到周圍環(huán)境的影響或抑制且易被蛋白酶消化，而人工酶可以克服天然酶的缺點(diǎn)。Tao等[128]構(gòu)建了具有過氧化物酶和氧化酶雙重酶活性的介孔二氧化硅負(fù)載金納米顆粒（mesoporous silica supported gold nanoparticle, MSN-AuNP）抗菌體系。MSN-AuNP引發(fā)的類過氧化物酶活性可以催化H2O2分解為?OH，且其類氧化酶活性可以生成ROS。MSNAuNP具有顯著的酶活性，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現(xiàn)出良好的抗菌能力和生物膜清除能力。具有類過氧化物酶活性的鐵磁性納米粒子（Fe3O4, MNP）可以催化過氧化氫的降解，從而有效降解DNA、蛋白質(zhì)和多糖等生物分子。此外，F(xiàn)e3O4、MNP可以增強(qiáng)H2O2清除生物膜的作用。H2O2單獨(dú)處理生物膜后，生物膜殘留率為49% ± 7.37%，而MNP-H2O2處理后，生物膜殘留達(dá)18% ± 6.17% [129]。這一差異表明MNP- H2O2比H2O2更能有效地降低細(xì)菌的活力。

3.5.2. 信號阻抑

群體感應(yīng)是調(diào)節(jié)生物膜群落發(fā)展和穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一。因此，研究者開發(fā)群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibition, QSI）以干預(yù)群體感應(yīng)的調(diào)控行為，如細(xì)胞黏附和細(xì)胞外聚合物的分泌。因此，群體感應(yīng)療法通常通過調(diào)節(jié)細(xì)菌間的交流使細(xì)胞喪失某些功能。QS的過程可以被不同的機(jī)制破壞：①抑制QS信號分子的合成；②降解QS信號分子；③降低QS信號分子的活性；④設(shè)計(jì)信號分子的類似物，從而競爭性地與受體蛋白結(jié)合[130]。在QS抑制方法中，降解信號分子和抑制AHL合成是目前比較具有潛力的生物膜控制方法。Singh等[131]研究了9種植物提取物（黑胡椒、肉桂、芫荽、孜然、大蒜、肉豆蔻、生姜、丁香和葫蘆巴）對C.sakazakii菌株QS介導(dǎo)的生物膜的抑制作用。利用生物指示物青紫色素桿菌026和根癌土壤桿菌NTL4 （pZLR4）測定在9種植物提取物對QS產(chǎn)物的影響，研究表明100 ppm的胡椒和肉桂分別導(dǎo)致QS產(chǎn)量下降78%和68%。并且，這兩種提取物對C.sakazakii生物膜的形成均表現(xiàn)出較高的抑制作用（>50%），而其他提取物對生物膜的抑制作用為中等（25%～50%）和較低（<25%）。該研究重點(diǎn)研究了黑胡椒和肉桂的抗群體感應(yīng)，以抑制C.sakazakii生物膜形成的潛在能力，為進(jìn)一步探索新的生物活性分子奠定基礎(chǔ)。當(dāng)然，其他植物提取物對QS的破壞方面的研究也仍需加強(qiáng)探究。

4.食品加工廠中Cronobacter spp.生物膜防控的建議

嬰幼兒配方奶粉之所以受Cronobacterspp.污染，可能與其生產(chǎn)環(huán)境、原料和工廠人員的傳播有關(guān)。其中，儲存罐、設(shè)備和操作室通常是微生物最易儲藏的場所（圖6）。工廠內(nèi)的“死角”（如裂縫、角落、接縫和墊）往往是生物膜在清洗后仍可殘留的區(qū)域。除了生物膜易殘留的設(shè)備外，過濾和集水區(qū)的氣溶膠顆粒也會引起細(xì)菌的滯留，從而形成生物膜。鑒于不同器具的實(shí)際應(yīng)用和操作需要（機(jī)器的大小、質(zhì)地、功能等），食品生產(chǎn)設(shè)施中的細(xì)菌不能僅僅用一種方法消滅，因此建議采用多種技術(shù)相結(jié)合用于殺菌。其中，材料表面改性是防止微生物黏附和隨后生物膜形成的一種非常實(shí)用的方法。當(dāng)解決食品環(huán)境中生物膜的生態(tài)復(fù)雜性時(shí)，這些策略可能會展現(xiàn)出進(jìn)一步的潛力。因此，對生物膜形成機(jī)制的清晰認(rèn)識，對于實(shí)現(xiàn)一種新穎、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的策略以確保食品安全具有至關(guān)重要的作用。

5. 結(jié)論與展望

高通量DNA測序技術(shù)極大地促進(jìn)了對生物膜形成的分子機(jī)制的全面了解。應(yīng)用各種手段可以大大減少生物膜的形成。特別是，接觸材料的改性可干擾生物膜形成的各個(gè)階段，從而達(dá)到生物膜的預(yù)防和控制。在抗菌物質(zhì)和材料聯(lián)合作用方面，最受歡迎和最有效的策略是表面涂層法，這是一種可直接靶向生物膜污染位點(diǎn)的方法。此外，由于受損的QS系統(tǒng)會進(jìn)一步影響細(xì)胞附著、微生物基質(zhì)分泌以及對其感染和致病性的預(yù)防，因此QS信號阻斷化合物也是很有前景的研究方向。

自20世紀(jì)80年代中期首次正式定義生物膜這個(gè)概念以來，我們對生物膜的探索有了長足的進(jìn)步。然而，Cronobacterspp.生物膜形成的相關(guān)研究仍處于起步階段，在未來的研究中可將生物化學(xué)、細(xì)胞、分子和遺傳學(xué)等相結(jié)合探究克羅諾桿菌生物膜的分子機(jī)制和功能。以下科學(xué)問題可能需要進(jìn)一步思考和探究。

（1）C.sakazakii菌毛合成特異分子的機(jī)制是什么？菌毛如何影響生物膜形成？

（2）C.sakazakii生物膜抵抗極端干燥環(huán)境的機(jī)制是什么？

（3）干燥處理是否改變C.sakazakii生物膜的組成成分，從而使其具有強(qiáng)抗干燥能力，其他細(xì)菌是否有相同的作用機(jī)制？

（4）研究表明，引發(fā)新生兒患腦膜炎的C.sakazakii致病菌株與K2:CA2型莢膜密切相關(guān)。該型別的莢膜成分是否能有利于該菌在嬰幼兒配方奶粉和胃中持留？

（5）在生物膜內(nèi)Cronobacterspp.如何與其他物種進(jìn)行交流？不同種類的細(xì)菌之間是否存在共用的群體感應(yīng)機(jī)制？

致謝

我們非常感謝國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC 1601200）、廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017A070702018）、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201604020003）及廣東省科學(xué)院實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2017GDASCX-0201）的支持。

Compliance with ethics guidelines

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