鄧名貴 周紅梅 張培燕 江潔雅 陳俊文 余治健 李多云

摘要：目的? 探討新型噁唑烷酮類抗菌藥物Radezolid和Linezolid對(duì)糞腸球菌浮游菌和生物膜形成的影響。方法? 收集臨床分離的202株糞腸球菌，用瓊脂稀釋法測(cè)定Radezolid和Linezolid的最低抑菌濃度（MIC），PCR擴(kuò)增23S rRNA 結(jié)構(gòu)域V區(qū)突變位點(diǎn)、核酸體蛋白基因rplC和rplD，cfr，cfr（B）以及optrA耐藥基因的攜帶情況，結(jié)晶紫染色半定量方法檢測(cè)藥物抑制菌株成熟生物膜形成的能力。結(jié)果? Radezolid（0.25、0.5 mg/L）對(duì)202株糞腸球菌的MIC50/MIC90比Linezolid（2、4 mg/L）低8倍;對(duì)于Linezolid非敏感的糞腸球菌，Radezolid體現(xiàn)更好的抑菌活性，Radezolid在1/4×MIC和1/8×MIC濃度下能更好地抑制糞腸球菌生物膜的形成。結(jié)論? Radezolid比Linezolid更有效地對(duì)抗浮游菌，并在亞抑菌濃度下能更好地抑制糞腸球菌成熟生物膜的形成。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌;Radezolid;Linezolid;生物膜形成

中圖分類號(hào)：R96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.15.025

文章編號(hào)：1006-1959（2020）15-0080-05

Abstract：Objective? To investigate the effects of new oxazolidinone antibacterial drugs Radezolid and Linezolid on enterococcus faecalis planktonic bacteria and biofilm formation.Methods? 202 clinically isolated Enterococcus faecalis were collected， and the minimum inhibitory concentration （MIC） of Radezolid and Linezolid was determined by agar dilution method， PCR amplification of 23S rRNA domain V region mutation sites， nucleic acid protein genes rplC and rplD， cfr， cfr（B） and optrA drug resistance gene carrying status， semi-quantitative method of crystal violet staining to detect the formation of mature biofilms of drug-inhibited strains ability.Results? The MIC50/MIC90 of Radezolid （0.25， 0.5 mg/L） against 202 strains of Enterococcus faecalis is 8 times lower than that of Linezolid （2， 4 mg/L）; Radezolid shows better antibacterial activity against Linezolid non-sensitive Enterococcus faecalis，Radezolid can better inhibit the formation of Enterococcus faecalis biofilm at 1/4×MIC and 1/8×MIC concentrations.Conclusion? Radezolid is more effective against planktonic bacteria than Linezolid， and it can better inhibit the formation of mature biofilm of Enterococcus faecalis at sub-inhibitory concentrations.

Key words：Enterococcus faecalis;Radezolid;Linezolid;Biofilm formation

糞腸球菌是重要的革蘭陽性球菌，是陽性菌醫(yī)院獲得性感染的第二位病原體，其迅速進(jìn)化對(duì)許多抗菌藥物均具有耐藥性。除了對(duì)多種抗菌藥物的內(nèi)在和獲得性耐藥性之外，多重耐藥腸球菌，特別是耐萬古霉素的腸球菌（VRE）的傳播進(jìn)一步縮小了抗感染藥物的選擇。以Linezolid為代表的噁唑烷酮類藥物是治療VRE感染的主要藥物之一[1]。然而，隨著Linezolid的廣泛應(yīng)用，耐Linezolid的分離株已在世界范圍被發(fā)現(xiàn)[2]。對(duì)噁唑烷酮藥物的開發(fā)和優(yōu)化改造促使新的抗菌藥物的產(chǎn)生，如Radezolid（RX-1741）[3]。研究顯示，Radezolid對(duì)多種革蘭氏陽性細(xì)菌（如葡萄球菌等）的抗菌活性約為Linezolid的11倍[4]。根據(jù)目前Radezolid完成的2項(xiàng)Ⅱ期試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的Radezolid在非復(fù)雜性皮膚軟組織感染和輕中度CAP中顯示出相當(dāng)?shù)寞熜?，然而，其安全性尚未明確，且相對(duì)于Linezolid的優(yōu)勢(shì)尚不清楚。既往研究表明，Linezolid耐藥性與23S rRNA V結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白（L3和L4）、cfr、cfr（B）和optrA介導(dǎo)的耐藥性的基因突變有關(guān)[5]。作為Linezolid的新一代類似物，Radezolid在糞腸球菌的抗菌活性和耐藥機(jī)制是否與Linezolid相似還有待研究。此外，既往報(bào)導(dǎo)Linezolid對(duì)糞腸球菌的生物膜有抑制作用[6]，但尚不清楚Radezolid對(duì)糞腸球菌的生物膜是否更有效。本研究擬比較Radezolid和Linezolid對(duì)屎腸球菌浮游細(xì)胞和生物膜的不同作用。

1材料與方法

1.1菌株和材料? 收集華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院2011～2016年臨床非重復(fù)糞腸球菌菌株202株，抗菌藥物L(fēng)inezolid和Radezolid購于上海MCE公司，MHB、TSB和Agar瓊脂購自O(shè)XOID公司，DNA提取液和PCR試劑和 DNA Maker 為TakaRa公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增儀器和酶標(biāo)儀均為BioRad公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1藥物敏感試驗(yàn)? 菌株經(jīng)血平板過夜復(fù)蘇，挑選單克隆，使用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定（IVD MALDI Biotyper，Germany），采用瓊脂稀釋法，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2017年規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥（R）、中介（I）和敏感（S），檢測(cè)Linezolid、Radezolid對(duì)糞腸球菌的MIC值，質(zhì)控菌為糞腸球菌ATCC29212，購自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.2糞腸球菌耐藥基因擴(kuò)增和測(cè)序? 分離菌株接種血平板復(fù)蘇后，挑取單克隆菌落加入盛有 50 μl DNA 裂解液（lysis buffer for microorganism to direct pcr）的 EP 管中，按照說明書裂解和提取DNA，取上清進(jìn)行PCR檢測(cè)，參考文獻(xiàn)[7]方法設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，采用PCR分別擴(kuò)增各菌株的4個(gè)拷貝23S rRNA V區(qū)基因、rplC和rplD基因、cfr，cfr（B）以及optrA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化，送生工生物工程（公司）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN.full.version.v5.2.2標(biāo)記變異的堿基位點(diǎn)、核糖體蛋白基因核苷酸及氨基酸位點(diǎn)，同時(shí)了解菌株cfr，cfr（B）以及optrA基因的攜帶情況，各基因擴(kuò)增引物序列見表1。

1.2.3抗菌藥物對(duì)浮游菌的生長的影響? 選擇臨床糞腸球菌16C106和16C350菌株進(jìn)行復(fù)蘇，接種至5 ml TSB培養(yǎng)基，37 ℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，將上述菌液用TSB培養(yǎng)基稀釋到OD=0.1，分別加入不同的亞抑菌濃度的Radezolid和Linezolid（1/32～1/2× MIC），各300 μl加入自動(dòng)力生長曲線儀器（美國Bioscreen C公司）配套孔內(nèi)，各三復(fù)孔，設(shè)置參數(shù)（每30 min讀取OD600值，共監(jiān)測(cè)24 h），繪制生長曲線。

1.2.4生物膜半定量分析? 參照課題組前期建立的方法[8]，通過體外96孔板法構(gòu)建生物膜感染模型，采用結(jié)晶紫半定量染色法檢測(cè)生物膜形成的量。選擇8株生物膜陽性的臨床糞腸球菌（16C1、16C35、16C106、16C124、16C138、16C152、16C166和16C350），檢測(cè)不同亞抑菌濃度下（1/32～1/4×MIC）Radezolid和Linezolid抑制菌株成熟（24 h）生物膜形成的能力。生物膜陰性對(duì)照菌株為ATCC29212，為避免實(shí)驗(yàn)誤差，臨床株和對(duì)照株均使用三復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。操作步驟簡(jiǎn)要如下：將菌株復(fù)蘇，接種至5 ml TSB培養(yǎng)基，37 ℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取生長期菌液1 ml于1.5 ml EP管中離心，菌體經(jīng)0.9%生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋聪喈?dāng)于1.0×108 cfu/ml），再用TSBG培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基+0.25%葡萄糖）將菌液1：200稀釋，菌液的最終濃度為5×105? cfu/ml，將上述菌液加入96孔板，100 μl/孔，同時(shí)加入不同濃度的抗菌藥物100 μl到上述96孔板內(nèi)，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，棄去菌液，用無菌0.9%生理鹽水洗去黏附細(xì)菌，重復(fù)洗滌3次，室溫下干燥后加入甲醇固定15 min（200 ul/孔），棄去甲醇室溫下干燥后每孔加入1%結(jié)晶紫染液100 μl，室溫下染色20 min，清水下輕柔洗脫結(jié)晶紫染液直至流水無色，室溫下干燥后在酶標(biāo)儀上讀取OD570值并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Linezolid和Radezolid對(duì)糞腸球菌的MIC分布? 由于目前CLSI標(biāo)準(zhǔn)中并沒有Radezolid的耐藥、中介及敏感的標(biāo)準(zhǔn)，且其在質(zhì)控菌ATCC29212的質(zhì)控范圍為0.06～0.5 mg/L，根據(jù)檢測(cè)到的MIC值，將Radezolid的MIC分為≤0.125、0.25、0.5和≥1 mg/L，將Linezolid的MIC分為≤1、2、4和≥8 mg/L，計(jì)算其MIC50和MIC90了解菌株的MIC值分布。在202株菌株中，Radezolid的MIC50和MIC90比Linezolid下降約8倍（0.25/0.5 mg/L vs 2/4 mg/L），對(duì)于32株Linezolid非敏感株（MIC≥4 mg/L），Radezolid同樣具有良好的抑菌活性， Radezolid比Linezolid具有更強(qiáng)的體外抑菌活性。

2.2糞腸球菌菌株的耐藥突變位點(diǎn)和耐藥基因分布? 在32株Linezolid非敏感的菌株中，有17株菌株存在至少1個(gè)拷貝以上的23S rRNA V區(qū)的位點(diǎn)突變，其變異位點(diǎn)包括G2621T、T2245C、G2251T、G2627A、G2253A、G2576A、C2646T、T2249A;4株菌株攜帶了optrA基因，所有菌株均未檢測(cè)到核糖體蛋白基因的變異位點(diǎn)，均未攜帶cfr和cfr（B）基因，見表2。

2.3 Radezolid和Linezolid對(duì)糞腸球菌浮游菌和生物膜的作用? 生長曲線顯示，除了1/2×MIC濃度外，其他亞抑菌濃度下，兩種抗菌藥物均不影響浮游菌的生長，見圖1;進(jìn)一步檢測(cè)兩種藥物在1/4× MIC、1/8× MIC、1/16× MIC和1/32× MIC條件對(duì)糞腸球菌24 h生物膜形成的抑制作用，結(jié)果顯示在1/4× MIC和1/8× MIC條件下，Radezolid更有效地抑制糞腸球菌生物膜的形成，見圖2。

3討論

做為新一代的噁唑烷酮類藥物，Radezolid對(duì)常用的多重耐藥陽性菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐Linezolid葡萄球菌均表現(xiàn)有較強(qiáng)的活性[9]。Radezolid與Linezolid的不同之處在于存在一個(gè)聯(lián)芳基和一個(gè)雜芳基側(cè)鏈，這在一定程度增加了Radezolid在生理pH下的電離性和親水性，并賦予它二元的特性，而且Radezolid具有良好的水溶性，可口服或靜注且耐受性較好。在本研究中，無論是Linezolid敏感菌，還是Linezolid非敏感菌，Radezolid的MIC50/MIC90比Linezolid （2/4 mg/L）低8倍。既往研究發(fā)現(xiàn)，在Linezolid耐藥的金黃色葡萄球菌中（MIC值在8～32 mg/L），Radezolid對(duì)菌株的抗性是Linezolid的2～8倍（1～4 mg/L）[9]。在本次研究中也同樣出現(xiàn)這一現(xiàn)象，在32株Linezolid非敏感的糞腸球菌（4～32 mg/L）中，Radezolid濃度（0.25～1 mg/L）比Linezolid濃度低8～32倍。與此同時(shí)，23S rRNA V區(qū)的變異是目前已知是Linezolid耐藥的主要機(jī)制之一，Locke? JB等[9]發(fā)現(xiàn)Radezolid對(duì)存在G2447T、G2576T 和 G2576T/T2571C位點(diǎn)突變的菌株也有良好的抑菌活性;Fulle S等[10]也通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計(jì)算發(fā)現(xiàn)G2032A-C2499A雙位點(diǎn)突變也導(dǎo)致了Linezolid的耐藥。本研究結(jié)果顯示，Linezolid非敏感菌株存在G2621T、T2245C、G2251T、G2627A、G2253A、G2576A、C2646T和T2249A的位點(diǎn)突變可能與Radezolid耐藥相關(guān)，提示一些菌株可能出現(xiàn)了Radezolid和Linezolid的交叉耐藥，需引起臨床足夠的重視，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)U2504和C2452位點(diǎn)是與Linezolid作用最直接的結(jié)合位點(diǎn)[10]，這對(duì)后續(xù)對(duì)噁唑烷酮類藥物的開發(fā)也提供了參考依據(jù)。

既往研究表明，Linezolid單獨(dú)或聯(lián)合其他常見抗菌藥物（如利福平、慶大霉素）有抑制糞腸球菌生物膜形成的作用[11-13]。本研究顯示，Radezolid對(duì)糞腸桿菌浮游細(xì)胞的作用強(qiáng)于Linezolid，在1/4×MIC和1/8×MIC的濃度下，Radezolid能更有效地抑制糞腸球菌生物膜的形成，提示在糞腸球菌生物膜感染中，Radezolid或許可以做為新的選擇，但需要更多的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究從糞腸球菌研究入手，比較Radezolid與Linezolid的抗菌活性和抗生物膜形成的活性，發(fā)現(xiàn)了Radezolid在抑制生物膜形成的優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限性，比如只采用了半定量生物膜分析的方法且菌株數(shù)量較少，后續(xù)在增加樣本的基礎(chǔ)上，使用生物膜活菌計(jì)數(shù)以及激光共聚焦顯微鏡等方法進(jìn)一步研究Radezolid對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺滅作用，為針對(duì)生物膜的治療策略提供數(shù)據(jù)參考。

綜上所述，Radezolid比Linezolid更有效地對(duì)抗浮游菌，并在亞抑菌濃度下能更好地抑制糞腸球菌成熟生物膜的形成。

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收稿日期：2020-07-02;修回日期：2020-07-13

編輯/成森