宗琪，張生才，范國泰，黃奕，胡黨振，姜玲*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北，武漢 430070；2.國家現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，福建永春蘆柑綜合試驗(yàn)站，福建泉州 362600；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，國家果樹脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心，農(nóng)業(yè)部華中地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

近幾年，PGA 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也不斷被開發(fā)利用，由于PGA 具有生物可降解性和高吸水性，可以將其應(yīng)用在沙漠和缺水地區(qū)。將PGA 制作成種子包衣材料，種植在沙漠及缺水地區(qū)，可以快速發(fā)芽。在施用肥料和農(nóng)藥時(shí)，加入適量的PGA，可以延長藥劑的作用時(shí)間[2]。PGA 還具有良好的生物降解性，在體內(nèi)環(huán)境下，因酶的生物作用可進(jìn)一步降解，在自然環(huán)境中受微生物的作用也可以降解，具有很好的生物相容性，并且無自身抗原性、可食無毒等優(yōu)點(diǎn)[3]。PGA 可作為土壤保水劑、肥料增效劑使用，能增強(qiáng)土壤的持水能力，提高肥料的利用率[4]。PGA 在糧食作物和園藝植物如煙草[5]、油菜[6]、水稻[7]、冬小麥[8]、玉米[9-10]、小青菜[11]、葡萄[12]等上的應(yīng)用已有不少報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)PGA 可以提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)。迄今為止，PGA 在柑橘苗木上的作用效果還未見報(bào)道。為了適應(yīng)柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，提高柑橘苗木質(zhì)量，本研究以柑橘實(shí)生苗和嫁接苗為試材，采用PGA 單獨(dú)處理、PGA 與磷酸二氫鉀和尿素組合處理兩種方案，觀察了柑橘的多項(xiàng)生長、生理指標(biāo)，并對葉片中的礦物元素含量進(jìn)行了檢測分析，從而為PGA 在柑橘良種繁育上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)方面的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為強(qiáng)德勒柚實(shí)生苗、永春蘆柑嫁接苗。

PGA 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。丙酮、乙醇、鹽酸、硝酸等均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S 萬分之一電子天平，北京SARTORIUS 有限公司；AUW120D 分析天平，沈陽天平儀器有限公司；DHG-9076A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；KQ-500DV 數(shù)控超聲波清洗器；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，安捷倫5100；分光光度計(jì)，上海儀器科技有限公司；游標(biāo)卡尺，北瑞科信北京智能科技有限公司。

1.3 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 強(qiáng)德勒柚實(shí)生苗

試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家果樹脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心進(jìn)行。利用強(qiáng)德勒柚新鮮果實(shí)，取出種子，去果膠，常規(guī)消毒，用自來水洗凈，將種子分成4組，分別用50、100、200 mg/L PGA 溶液和清水（對照）浸泡12 h，剝?nèi)ネ夥N皮和內(nèi)種皮，每缽播種5 粒種子，每個(gè)處理種10 個(gè)培養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石。成苗后供后續(xù)生長、生理指標(biāo)測試用。

1.3.2 蘆柑嫁接苗

試驗(yàn)地點(diǎn)在福建省永春綠源柑橘苗木繁育廠1 號育苗網(wǎng)室，于2017 年3 月8 日進(jìn)行第一次處理，4 月6日第二次處理，5 月6 日第三次處理，7 月10 日觀察統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

試驗(yàn)分兩組：第一組2 個(gè)處理（A1、B1）和1 個(gè)對照（C1）。A1 處理：100 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；B1 處理：200 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；對照組C1：清水灌根，每株200 mL。第二組2 個(gè)處理（A2、B2）和一個(gè)對照（C2）。A2 處理：100 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%尿素（Urea）噴施葉面，每株200 mL；B2 處理：200 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%Urea 噴施葉面，每株200 mL；對照組C2：清水噴施葉面，每株200 mL。

每個(gè)處理均為60 株嫁接苗，進(jìn)行觀測和統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 強(qiáng)德勒柚實(shí)生苗生長指標(biāo)的測定

發(fā)芽率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算。根長和株高測定是將35 d 的幼苗整株從蛭石中取出，用清水洗凈根部基質(zhì)，用直尺測量，測定10 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用天平分別稱量地上部分鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量，測定5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，按文獻(xiàn)[13]計(jì)算根冠比。按文獻(xiàn)[14]測定葉面積，觀察8 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2 強(qiáng)德勒柚實(shí)生苗葉綠素含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]測定葉綠素的含量。從生長35 d 的植株上采樣，取新鮮葉片，去掉中脈，剪碎，稱取樣品0.5 g，分別放入研缽中，加12 mL 95%乙醇和少量石英砂，研成均漿至組織變白，靜置5 min。把提取液倒入漏斗中，過濾到25 mL 容量瓶中，用95%乙醇沖洗殘?jiān)鼣?shù)次，并定容至25 mL，在波長665、649 nm 下分別測定吸光度A，分組準(zhǔn)確記錄，每個(gè)處理測定3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。按照公式（1）（2）計(jì)算葉綠素a、b 的含量，根據(jù)式（3）進(jìn)一步求出葉綠素的含量。

1.4.3 強(qiáng)德勒柚實(shí)生苗可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法（Bradford 法）進(jìn)行。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用1 000 滋g/mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，根據(jù)文獻(xiàn)[15]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取新鮮柑橘葉片0.5 g/樣，加2 mL 蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6 mL 蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，在室溫下放置1 h 后過濾于10 mL 帶塞的試管中，定容至刻度，即得待測樣品提取液。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

蛋白質(zhì)含量的測定：先取10 mL 帶塞試管，分別吸取待測樣品0.1 mL，各加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，在595 nm 波長下比色，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中可溶性蛋白質(zhì)的含量[15]，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.4.4 蘆柑嫁接苗礦物元素的檢測方法

永春蘆柑嫁接苗的灰化提取方法是將葉片放入105 益的烘箱中殺酶30 min，再65 益烘干。將葉片磨碎成粉末，用坩堝精確稱取0.500 0 g 樣品，作好標(biāo)記，將稱量好的樣品放進(jìn)馬弗爐中，設(shè)置溫度為550 益，待馬弗爐的溫度升到550 益，灰化5 h，然后關(guān)閉馬弗爐，冷卻后取出樣品；將灰化好的樣品按次序擺好，用移液槍吸取10 mL的溶液（60%H2O+30%HCl+10%HNO3），放進(jìn)坩堝，提取時(shí)間為30 min；將提取液倒進(jìn)漏斗中過濾，將過濾好的溶液稀釋3 倍，然后用ICP-OES 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGA 對柚實(shí)生苗生長的影響

經(jīng)過35 d 的溫室培養(yǎng)，對PGA 處理后柚種子萌發(fā)和幼苗生長狀況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明：對照和處理的種子發(fā)芽率均為100%。孕鄖粵處理對柚苗生長的影響見表1，由表1 可知，50、100、200 mg/L 的PGA 處理柚種子后，其幼苗根長比對照分別提高3.1%、4.8%和9.7%，株高比對照分別提高了6.3%、2.2%和0.9%。PGA 濃度為100 mg/L時(shí)，根鮮質(zhì)量顯著高于對照和200 mg/L PGA 處理的苗。PGA 濃度為100 mg/L 時(shí)，根冠比高于200 mg/L PGA 處理的。三種濃度PGA 處理的葉面積比對照的葉面積分別增大14.7%、20.6%和16.6%，差異均達(dá)到顯著水平。上述數(shù)據(jù)說明PGA 有促進(jìn)實(shí)生苗營養(yǎng)生長的作用，為提高柑橘實(shí)生苗的光合作用效率奠定了基礎(chǔ)，其中100 mg/L PGA 處理效果較好。

2.2 PGA 對柚苗葉綠素和可溶性蛋白含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素和捕獲光的主要成分。高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b 兩種。葉綠素a 和b 僅在吡咯環(huán)域上的附加基團(tuán)上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。葉綠素a 最大吸收光的波長在420～663 nm，葉綠素b 的最大吸收波長范圍在460～645 nm。本試驗(yàn)測定了葉綠素a 和葉綠素b 含量，結(jié)果見表2。由表2 可知，100、200 mg/L PGA 處理柚苗后，葉綠素a 含量均顯著高于50 mg/L PGA 處理和對照的。PGA 濃度為200 mg/L 時(shí)，葉綠素a含量達(dá)到最大，葉綠素遭含量沒有明顯變化。

表1 聚-谷氨酸處理對柚苗生長的影響Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

表1 聚-谷氨酸處理對柚苗生長的影響Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

注：不同小寫字母表示相互間差異顯著（）。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，也經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)表明：可溶性蛋白的線性回歸方程為說明吸光度與可溶性蛋白濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。由表2 可知，當(dāng)100、200 mg/L PGA 處理苗木后，可溶性蛋白含量均極顯著地高于對照樣品。100 mg/L PGA 處理后，可溶性蛋白達(dá)到最高值。

表2 PGA 對葉綠素和可溶性蛋白含量影響Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

表2 PGA 對葉綠素和可溶性蛋白含量影響Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

注：不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著（

2.3 PGA 對柑橘嫁接苗多項(xiàng)生長指標(biāo)的影響

在第一組試驗(yàn)中，A1 和B1 處理與對照相比，嫁接苗根數(shù)分別增加40.5%和8.1%，根長分別增加8.1%和23.3%，差異均不顯著（圖1A 和1B）。對植株高度進(jìn)行比較，B1 處理與對照的差異達(dá)到顯著水平，A1 與B1 處理差異達(dá)到顯著水平（（圖1C）。對植株冠徑進(jìn)行比較，可知A1 和B1 處理與對照的差異均達(dá)到顯著水平，A1 與B1 處理的差異不顯著（圖1閱）。對干徑進(jìn)行比較，可知A1 和B1 處理與對照的差異均達(dá)到顯著水平，但A1 與B1 處理的差異不顯著，兩種濃度的PGA 都能顯著增加植株的粗度（圖1耘），使植株更為健壯。

在噴施PGA、KH2PO4和Urea 的第二組試驗(yàn)中，A2和B2 處理后，與對照相比，根數(shù)分別增加17.3%和15.3%，根長分別增加17.3%和4.6%，A2、B2 和對照的差異均未達(dá)到顯著水平（圖1云和1鄖）。處理和對照的株高差異也未達(dá)到顯著水平（圖1勻）；冠徑比較，A2 和B2 處理與對照的差異均達(dá)到顯著水平（圖1隕）；對干徑進(jìn)行比較，A2 和B2 處理與對照的差異均達(dá)到顯著水平，但A2 處理與B2 處理差異不顯著（圖1允），可見，不同濃度的PGA 與0.2%KH2PO4和0.2%Urea 配合均能增加樹干粗度，PGA 處理對嫁接苗地上部分的促進(jìn)生長比地下部分更明顯。

2.4 PGA 對柑橘葉片中P、Na 和Zn 元素含量的影響

磷是植物必需的大量元素之一，在生物遺傳信息和能量傳遞中起極其重要的作用。鈉是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，植物缺鈉后會(huì)出現(xiàn)黃化病。鋅在植物體內(nèi)主要是作為酶的金屬活化劑。本研究對永春蘆柑苗木中的大量和微量元素進(jìn)行了分析，如表所示。

表3 PGA 處理柑橘嫁接苗后葉片中大量和微量元素含量（mg/L）Table 3 Macroelements and microelements contents in leaves after PGA treatment(mg/L)

3 討論

試驗(yàn)證明PGA 能提高柚實(shí)生苗根的鮮質(zhì)量和葉面積，可增加葉片的葉綠素a 和可溶性蛋白含量，有助于嫁接苗株高、冠徑和干徑的增加。在光合作用中，絕大部分葉綠素的作用是吸收及傳遞光能，僅極少數(shù)葉綠素a 分子起轉(zhuǎn)換光能的作用，它們在活體中是與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，存在于類囊體膜上。提高葉綠素a 含量有利于提高光合作用效率[16]?？扇苄缘鞍资侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一?？扇艿鞍踪|(zhì)含量的提高，還會(huì)增加細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細(xì)胞正常代謝[17]。可見PGA 能加強(qiáng)光合作用和促進(jìn)生長指標(biāo)的改善，提高細(xì)胞的代謝功能。

PGA 還可提高磷元素的利用率。磷是礦質(zhì)元素，吸收動(dòng)力靠蒸騰作用，它又是一種無機(jī)鹽，無機(jī)鹽需要與水一起進(jìn)入植物的體內(nèi)，植物是靠根尖成熟區(qū)吸收的。當(dāng)植物體外的無機(jī)鹽濃度大于植物成熟區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞液濃度時(shí)，植物體就會(huì)從外界吸收無機(jī)鹽。細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸需要消耗ATP，主動(dòng)運(yùn)輸是逆濃度階梯運(yùn)輸?shù)?，由于磷離子較大，要靠細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)消耗能量來運(yùn)輸[18]。植物磷營養(yǎng)高效利用通常與根形態(tài)、根分泌物、膜與體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)以及菌根等因素有關(guān)，表現(xiàn)為受多基因控制。

本試驗(yàn)證明PGA 處理柑橘，能促進(jìn)實(shí)生苗和嫁接苗的根系生長，增加根的數(shù)量，這意味著根尖成熟區(qū)吸收磷的機(jī)會(huì)增加。PGA 可以提高磷元素利用率的另一個(gè)可能原因是PGA 通過與形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而起到磷肥緩釋劑的作用。植物對一些離子的吸收和利用與離子結(jié)合常數(shù)的大小有關(guān)。前人研究報(bào)道，PGA 與的結(jié)合常數(shù)，PGA 與Na+的結(jié)合常數(shù)由于PGA與離子產(chǎn)生絡(luò)合作用，可以通過緩效釋放過程提高柑橘對P 和Na 的吸收。

大量苗木實(shí)地試驗(yàn)證明，PGA 處理對柑橘苗木營養(yǎng)生長的促進(jìn)作用非常明顯。PGA 灌根處理能顯著增加株高、冠徑和干徑。PGA 與KH2PO4、Urea 組合葉面噴施，能提高冠徑和干徑，PGA 對苗木根系根數(shù)和根長有一定的促進(jìn)作用，但其效果還沒有達(dá)到顯著水平。通過上述兩組試驗(yàn)可知，PGA 處理后的苗木葉片增厚，葉色深綠，苗木強(qiáng)壯，這就為苗木后續(xù)的生殖生長奠定了基礎(chǔ)。PGA 是綠色安全、環(huán)保的多肽化合物，能顯著提高柑橘嫁接苗的質(zhì)量。如果這項(xiàng)技術(shù)能夠廣泛地推廣和應(yīng)用，對于提高柑橘苗木質(zhì)量、發(fā)展無病毒良種繁育有非常重要的意義。

然而PGA 在柑橘上使用時(shí)，可能含有少量的活菌存在，但主要的作用還在于多肽分子化合物。即使有活菌，即地衣芽孢桿菌的存在，也是起益生菌的作用。但本試驗(yàn)過程中，我們認(rèn)為起主要作用的還是PGA。PGA 與其它菌肥相比，有其優(yōu)勢。益生菌的作用機(jī)制主要包括拮抗作用、競爭作用、重寄生作用、誘導(dǎo)植物抗性、促進(jìn)植物生長等，益生菌在田間條件下可能是多種機(jī)制共同作用，也可能在植株不同發(fā)育時(shí)期、不同部位某一機(jī)制在起作用，以達(dá)到抑制病原的生長、繁殖或殺滅病原的效果。拮抗作用指一種微生物在其生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)對其他微生物的活性產(chǎn)生抑制甚至殺滅作用。競爭作用指兩種或多種微生物爭奪生存空間、位點(diǎn)、營養(yǎng)、水分等，益生菌能在植物體內(nèi)成為優(yōu)勢菌種，從而限制其它致病菌的生長。植物抗性的產(chǎn)生有兩種誘導(dǎo)途徑：一是系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR），病原物侵染后，未接種部位誘導(dǎo)出對病原物的抗性；二是誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance，ISR），非病原物刺激植物后，使植物體產(chǎn)生物理或化學(xué)屏障，從而增強(qiáng)抗性。益生菌也可通過促進(jìn)植物生長的作用，從而提高植株抗病性。因此，今后可以對PGA 的作用機(jī)制作更深入的探索，從而為PGA 在植物上的應(yīng)用奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。