余平蓮，程立君，李俊杰，熊汝琴，龔建康，馬麗嬌

（昭通學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南昭通 657000）

玉米蛋白粉是玉米淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，大約含有60%的蛋白質(zhì)，但由于其組成復(fù)雜、口感粗糙、水溶性非常差，嚴(yán)重限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1]。玉米活性肽是以玉米蛋白粉為原料，經(jīng)過水解后得到的分子量小但是活性很高的短肽分子所組成的混合物[2]，相對于氨基酸或蛋白質(zhì)來說，玉米活性肽更容易被人體吸收，而且在較大范圍pH 值下完全溶于水，無渾濁和沉淀產(chǎn)生。除此之外，玉米活性肽的熱穩(wěn)定性好，且沒有毒副作用，玉米活性肽是一種安全可靠的天然食品蛋白[3]。

玉米蛋白水解后得到的玉米活性肽大幅度提高了其溶解性，使起泡性增加，黏性降低，同時(shí)去除了不良風(fēng)味等。而且，通過酶解玉米蛋白制備的玉米肽具有降血壓[4-5]、促進(jìn)酒精代謝[6-7]、防治肝性腦病、抗氧化[8]、抗疲勞[9]等生理功能。因此，玉米活性肽是一種安全穩(wěn)定并且性能良好的生理活性肽。

玉米活性肽的制備方法很多，目前使用較多的是酶解法和微生物發(fā)酵法，酶解法具有作用專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、無不良副反應(yīng)、反應(yīng)進(jìn)程容易控制等特點(diǎn)[10]。酶的水解具有很高的選擇性，其水解特性需要用嚴(yán)格的條件加以控制。因此，對酶的選擇至關(guān)重要。選用堿性蛋白酶和胃蛋白酶2 種酶，以水解度為指標(biāo)進(jìn)行雙酶分步水解，以先加胃蛋白酶后再加堿性蛋白酶為添加順序，考查制備玉米肽的最佳條件，在酶解合適條件下，研究玉米肽的抗氧化功能，為玉米肽的制備和功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉，邢臺平安糖業(yè)有限公司提供；堿性蛋白酶（10 萬U/g），四川省山野生物科技有限公司提供；胃蛋白酶（3 000 U/g），蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供；DPPH 自由基，臨邑縣宏源化工商行提供；牛血清白蛋白，上海雪滿生物科技有限公司提供；考馬斯亮藍(lán)G250，上海浩然生物技術(shù)有限公司提供。

752PC 型紫外可見分光光度計(jì)，天津冠澤科技有限公司產(chǎn)品；XMTD-204 型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FE20 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，梅特勒—托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 酶解液的制備

取一定量的玉米蛋白粉，將其制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的玉米蛋白溶液。用NaOH 溶液或HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值至酶作用的最適值，于恒溫水浴鍋中加熱至酶作用的溫度。將一定量酶用磷酸二氫鉀緩沖液溶解活化后加入到蛋白液中，啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)每隔0.5 h調(diào)pH 值至起始值，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后停止加熱攪拌，酶解結(jié)束。

1.2.2 雙酶水解法

基本操作同1.2.1，按胃蛋白酶作用條件進(jìn)行水解，一定時(shí)間后，再調(diào)至堿性蛋白酶的作用條件，水解一定時(shí)間至酶解結(jié)束。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1） 設(shè)定堿性蛋白酶酶解時(shí)間1.0 h，加酶量0.064 g，pH 值為9，按照40，50，60，70 ℃酶解溫度進(jìn)行水解；胃蛋白酶酶解時(shí)間1.0 h，加酶量0.004 g，pH 值為2，按照50，55，60，65 ℃酶解溫度進(jìn)行水解，考查溫度對酶解效果的影響，選出較優(yōu)水解溫度。

（2） 設(shè)定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，加酶量0.064 g，pH 值為9，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解時(shí)間進(jìn)行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，加酶量0.004 g，pH 值為2，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解時(shí)間進(jìn)行水解，考查時(shí)間對酶解效果的影響，選出較優(yōu)水解時(shí)間。

（3） 設(shè)定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1.0 h，pH 值為9，按照加酶量0.032，0.064，0.096，0.128 g 進(jìn)行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間1.0 h，pH 值為2，按照加酶量0.002，0.004，0.006，0.008 g 進(jìn)行水解，考查加酶量對酶解效果的影響，選出較優(yōu)加酶量。

（4） 設(shè)定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1.0 h，加酶量0.064 g，按照pH 值9，10，11，12進(jìn)行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間1.0 h，加酶量0.004 g，按照pH 值1.8，1.9，2.0，2.1進(jìn)行水解，考查pH 值對酶解效果的影響，選出較優(yōu)pH 值，結(jié)果以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量及pH 值4 個(gè)因素選取3 個(gè)水平進(jìn)行考查，以水解度為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。同樣，以該因素表通過DPPH 自由基清除試驗(yàn)考查了玉米肽抗氧化能力。

堿性蛋白酶試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，胃蛋白酶試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表1 堿性蛋白酶試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 胃蛋白酶試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 雙酶水解試驗(yàn)

（1） 酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊懺囼?yàn)。選取6%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)按酶解單元操作進(jìn)行試驗(yàn)，按不同順序加酶。先加胃蛋白酶設(shè)定酶解條件為酶解時(shí)間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度60 ℃，再加堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)酶解條件為時(shí)間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度50 ℃。

（2） 不同溫度對水解效果的影響試驗(yàn)。堿性蛋白酶的最適溫度為50 ℃，胃蛋白酶的最適溫度為60 ℃，在底物濃度為6%的條件下，設(shè)置2 組試驗(yàn)，一組是先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶，按酶解單元操作對玉米蛋白粉進(jìn)行雙酶水解，胃蛋白酶設(shè)定酶解條件為酶解時(shí)間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度50 ℃，再加堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)酶解條件為時(shí)間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度50 ℃。另一組先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶，按酶解單元操作對玉米蛋白粉進(jìn)行雙酶水解，胃蛋白酶設(shè)定酶解條件為酶解時(shí)間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度60 ℃，再加堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)酶解條件為時(shí)間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度60 ℃。

（3） 不同時(shí)間對水解效果的影響試驗(yàn)。根據(jù)上述確定的條件，再分別確定胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解時(shí)間。在胃蛋白酶分別水解1.0，1.5，2.0 h時(shí)，分別加堿性蛋白酶再水解2 h，在堿性蛋白酶水解1.0，1.5，2.0 h 時(shí)分別測定水解度。

1.2.6 水解度（DH） 的測定

水解度（DH） 的測定采用pH-stat 滴定法[11]，pH-stat 法是依據(jù)恒定的pH 值條件下酶水解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸殘基數(shù)目不等，多肽在不同的pH 值下解離狀態(tài)的不同而計(jì)算蛋白的水解度。水解開始時(shí)，調(diào)節(jié)體系的pH 值到某值，反應(yīng)結(jié)束后再測定體系的pH 值，用一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH 溶液將體系的pH 值調(diào)回到反應(yīng)開始時(shí)的值，通過記錄堿液的消耗量，得出蛋白的水解度。按下式計(jì)算出水解度：

1.2.7 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

采用對DPPH 自由基清除活性的測定獲得玉米活性肽的抗氧化活性，具體操作為：稱取0.049 g DPPH 自由基溶解在50 mL 無水乙醇中，然后取6 mL DPPH 自由基溶解液于試管中，加入8 mL 酶解液，在室溫下放置30 min。立即倒入比色杯中，于波長517 nm 處進(jìn)行實(shí)踐掃描，測定吸光度，重復(fù)3 次。再用8 mL 蒸餾水做空白試驗(yàn)。

自由基清除活性計(jì)算如下：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANVO），顯著水平為p<0.05；采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖1。

圖1 不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖1 可知，隨著溫度的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。堿性蛋白酶在50 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大值，這是因?yàn)樵诿傅淖钸m溫度反應(yīng)活性最強(qiáng)，超過酶的最適溫度后，酶分子的空間結(jié)構(gòu)由于溫度的增加而發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性減弱或喪失，而影響催化效果，因而水解度急劇下降，選擇40，50，60 ℃3 個(gè)水平參與正交試驗(yàn)。胃蛋白酶也是同樣的原理，在60 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大值，超過最適溫度后，水解度下降，因此選擇55，60，65 ℃參與正交試驗(yàn)。

不同時(shí)間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖2。

圖2 不同時(shí)間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖2 可知，隨著時(shí)間的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶的水解度均呈現(xiàn)上升的趨勢。堿性蛋白酶在反應(yīng)時(shí)間少于1 h 時(shí)，水解度顯著增高，而反應(yīng)時(shí)間超過1 h 后，水解度上升緩慢。這是因?yàn)閯傞_始酶與底物接觸充分，快速發(fā)生反應(yīng)，但是隨著時(shí)間的增加，底物濃度降低，生成的產(chǎn)物也隨之減少，反應(yīng)速度也降低。胃蛋白酶的水解度隨時(shí)間的延長而增高。2 組試驗(yàn)均選擇1.0，1.5，2.0 h 參與正交試驗(yàn)。

不同加酶量對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖3。

圖3 不同加酶量對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖3 可知，隨著加酶量的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈現(xiàn)先快速上升后緩慢上升的趨勢，這可能是因?yàn)槭艿降孜餄舛鹊南拗啤?/p>

pH 值對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖4。

圖4 pH 值對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖4 可看出，隨著pH 值的增加，水解度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，堿性蛋白酶在pH 值為10時(shí)水解度達(dá)到最大，胃蛋白酶在pH 值為2 時(shí)水解度達(dá)到最大。這是因?yàn)閜H 值過高或過低都會改變酶的空間結(jié)構(gòu)，甚至使酶失活；另外，pH 值還可能改變底物的解離狀態(tài)，影響底物和酶的結(jié)合，進(jìn)而影響水解的效果。因此，堿性蛋白酶和胃蛋白酶分別選取pH 值為9，10，11 和1.9，2.0，2.1 參與正交試驗(yàn)。

2.2 酶解條件的優(yōu)化結(jié)果

通過正交試驗(yàn)，確定了堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解的最適溫度、時(shí)間、加酶量和pH 值。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

通過極差分析得出，堿性蛋白酶水解度各因素影響的主次關(guān)系為D>A>C>B，pH 值對水解度的影響最大，最佳配比為A3B2C3D3，即最適溫度為60 ℃，最佳時(shí)間為1.5 h，最佳加酶量為0.128 g，最佳pH 值為11。此結(jié)果不在正交試驗(yàn)表中，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，A3B2C3D3條件下進(jìn)行水解得到水解液的水解度為13.63%，高于A3B2C1D3條件下水解度，因此選擇A3B2C3D3作為最佳值。胃蛋白酶水解各因素影響的主次關(guān)系為C>D>A>B，加酶量對水解的影響最大，最佳配比為A2B2C3D1，即最佳溫度為60 ℃，最佳時(shí)間為1.5 h，最佳加酶量為0.008 g，最佳pH 值為2.1，在此條件下進(jìn)行水解得到水解液的水解度為22.12%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 酶添加順序?qū)A性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶的作用效果好于先加堿性蛋白酶后加胃蛋白酶。前者水解液的水解度為22.12%，而后者為13.63%?？赡苁且?yàn)槲傅鞍酌杆饽芰^強(qiáng)，作用位點(diǎn)較多，水解一段時(shí)間之后，得到的可溶性短肽暴露出了較多的利于堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)，水解效果較好。

2.4 不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，50 ℃時(shí)水解度為28.74%，而60 ℃時(shí)，水解度為28.96%，這可能是因?yàn)槲傅鞍酌钙鸬剿獾闹鲗?dǎo)作用，所以確定雙酶水解的溫度為60 ℃。

2.5 不同反應(yīng)時(shí)間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖5。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖5 可知，胃蛋白酶水解1.5 h 時(shí)加入堿性蛋白酶，水解度達(dá)到最高值。因此，確定胃蛋白酶的水解時(shí)間為1.5 h。因加入堿性蛋白酶后水解度持續(xù)上升，確定堿性蛋白酶的水解時(shí)間為2 h。雙酶水解效果與單酶水解效果相比，水解度得到了明顯的提高，且水解玉米蛋白粉的效果更徹底，肽的分子量越小，更加符合生理活性肽的要求。

2.6 玉米肽抗氧化性的測定結(jié)果

利用單酶和雙酶水解后的玉米肽進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，以自由基清除率為指標(biāo)。

酶解后的玉米肽抗氧化最佳條件見表4。

表4 酶解后的玉米肽抗氧化最佳條件

由表4 可知，在2 種酶抗氧化的最佳條件下及在此最佳條件下的雙酶水解中，堿性蛋白酶的自由基清除率最大為25.62%。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對玉米蛋白粉進(jìn)行酶解制備玉米活性肽，以水解度為指標(biāo)，分別對2 種酶水解進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行雙酶分步試驗(yàn)（先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶），得到水解度與單酶試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，然后進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最優(yōu)條件，并測定DPPH 自由基清除率以及酸度得出玉米活性肽的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過正交試驗(yàn)得到2 種酶的最水解條件為堿性蛋白酶最適溫度60 ℃，最佳時(shí)間1.5 h，最佳加酶量0.128 g，最佳pH 值11，在此條件下進(jìn)行水解得到水解液的水解度為13.63%；胃蛋白酶最佳溫度為60 ℃，最佳時(shí)間為1.5 h，最佳加酶量為0.008 g，最佳pH 值為2.1，在此條件下進(jìn)行水解得到水解液的水解度為22.12%。

由于酶具有的單一性特點(diǎn)導(dǎo)致單一酶水解肽鍵位點(diǎn)有限，所以考慮使用雙酶水解的方法來提高水解液的水解度。由于2 種酶最適pH 值相差較大，不能同時(shí)加入水解液中，所以采用先加一種酶反應(yīng)一段時(shí)間后再調(diào)至另一種酶的作用條件，加入另一種酶反應(yīng)相應(yīng)時(shí)間的分布水解方式。確定了雙酶水解的方法后再確定酶添加順序、溫度、時(shí)間等條件。最終結(jié)果為雙酶水解液的水解度29.88%，明顯高于單酶水解，可見雙酶水解制備玉米肽的產(chǎn)量較高。

在最優(yōu)條件下，采用堿性蛋白酶水解得到的玉米肽對DPPH 自由基清除率最大為25.62%，抗氧化性最好。