張露露，王 炯

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種常見的呼吸道慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究結(jié)果表明：復(fù)雜的基因與環(huán)境之間相互作用共同參與了哮喘的發(fā)病，可能是患者先后暴露于環(huán)境后表觀遺傳改變的結(jié)果，如DNA甲基化修飾、組蛋白共價(jià)修飾、miRNA改變、染色質(zhì)改變等[1-2]，針對(duì)表觀遺傳學(xué)的治療有可能為哮喘個(gè)體化精準(zhǔn)治療開辟新的途徑。該研究對(duì)臨床收集的哮喘急性發(fā)作期患者及健康對(duì)照者外周血全基因組DNA甲基化進(jìn)行檢測(cè)，并與下載的GSE56553數(shù)據(jù)庫(kù)中的 96個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)樣本取交集，對(duì)差異基因功能通路進(jìn)行生物學(xué)分析，探討哮喘急性發(fā)作期患者與健康對(duì)照者之間DNA甲基化表觀遺傳學(xué)差異，以期篩選出哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，為哮喘治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與材料收集2018年8月～2019年9月經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科明確診斷為哮喘急性發(fā)作期的成人患者及同期健康體檢者2 ml外周血標(biāo)本各3份?；颊咧橥? 自愿參與研究, 并簽署知情同意書。GSE56553數(shù)據(jù)庫(kù)為96例國(guó)人外周血標(biāo)本Illumina DNA甲基化芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)集，其中正常人24例，哮喘急性發(fā)作期患者72例。

1.2 主要試劑與儀器PureLink Genomic DNA Mini KIT購(gòu)自德國(guó)賽默飛世爾科技公司；基因芯片儀器：雜交爐、振蕩器、Hyb Chambers 雜交盒、Hyb Chamber inserts均購(gòu)自美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1主要實(shí)驗(yàn)步驟 本研究主要實(shí)驗(yàn)步驟依次如下：① 提取哮喘急性發(fā)作期及健康對(duì)照者外周血DNA；② 采用Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片，對(duì)提取的外周血DNA進(jìn)行全基因組DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)，并與健康對(duì)照者甲基化譜進(jìn)行比較，獲得甲基化差異基因；③ 對(duì)篩選出來(lái)的哮喘患者外周血特異性甲基化基因進(jìn)行GO/KEGG功能富集分析，以探討差異性甲基化基因具體參與分子通路以及與哮喘發(fā)病的具體關(guān)系。

1.3.2外周血DNA甲基化芯片檢測(cè) 本研究采用的甲基化特異性芯片為IllulIlina Human methlylation 450K Beadcllip全基因組甲基化芯片，提取外周血DNA后，重亞硫酸鹽處理獲得gDNA，處理后的gDNA和每種探針互補(bǔ)雜交，再利用芯片上的特異性捕獲探針和互補(bǔ)的酶切基因片段結(jié)合之后，雜交過(guò)夜、清洗、延伸、染色、掃描獲得原始數(shù)據(jù)。甲基化的程度根據(jù)兩種探針的熒光強(qiáng)度判斷。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用 Benjamini & Hochberg 方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)糾正計(jì)算得到調(diào)整后的P值，根據(jù)調(diào)整后的P值篩選出差異的探針位點(diǎn)，根據(jù)探針?biāo)接?jì)算甲基化差異程度(beta值)。下載GSE56553數(shù)據(jù)庫(kù)中甲基化的數(shù)據(jù)。運(yùn)用R語(yǔ)言包ChAMP對(duì)甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用內(nèi)置的色彩校正和背景減法進(jìn)行陣列歸一化，并使用lumi包的分位數(shù)歸一化函數(shù)進(jìn)行默認(rèn)設(shè)置，然后使用基于峰值的校正。差異甲基化的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05，篩選出1 493個(gè)差異甲基化基因。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 甲基化差異基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)哮喘急性發(fā)作期患者和健康對(duì)照者外周血全基因組DNA進(jìn)行甲基化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組甲基化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)，篩選出差異基因有1 493個(gè)，甲基化程度明顯上調(diào)基因有923個(gè)，降低基因有570個(gè)，部分差異基因見表1。甲基化差異區(qū)域(DMRs)見表2。

2.2 GO/KEGG功能富集分析根據(jù)分析結(jié)果列表顯示，共有422個(gè)差異甲基化基因的功能類別，包含了17 283個(gè)基因。其中生物過(guò)程和細(xì)胞組分部分含有的基因功能類別富集最多；從生物進(jìn)程、通過(guò)細(xì)胞組分和分子功能方面對(duì)差異基因進(jìn)行了全面的注釋，差異基因主要富集通路和功能見圖2。根據(jù)柱狀圖顯示甲基化差異基因的集中在突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、突觸膜形成、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、肌肉收縮、無(wú)機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等類別上。為進(jìn)一步研究?jī)山M直接差異基因所參與的通路功能，進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路分析。篩選出富集程度最高的20條通路(見圖3)，甲基化差異基因主要涉及磷脂酶D信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、Rap通路、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用等功能。結(jié)合GO和KEGG通路功能富集分析，提示哮喘發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，與各種信號(hào)通路激活相互作用有密切關(guān)聯(lián)。

圖1 哮喘患者和健康對(duì)照者外周血全基因組DNA甲基化位點(diǎn)熱圖

表1 哮喘患者與健康對(duì)照者部分甲基化差異基因

表2 哮喘患者和健康對(duì)照者差異甲基化主要涉及的區(qū)域

圖2 GO通路分析結(jié)果

圖3 KEGG通路分析結(jié)果

2.3 核心基因篩選通過(guò)STRING v11數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)1 493 個(gè)差異基因進(jìn)行基因相互作用的分析。限定研究物種為“Homo sapiens”，得到初始基因質(zhì)互作關(guān)系，限定“minimum required interaction score”為0.5，進(jìn)一步得到由726個(gè)差異基因參與的基因質(zhì)互作關(guān)系，把726個(gè)差異基因及其間關(guān)聯(lián)的“combined score”另外導(dǎo)入Cytoscape 軟件中得到初始基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，用NetworkAnalyzer 對(duì)其進(jìn)行分析，導(dǎo)出分析結(jié)果后用Microsoft Office Excel 2007 對(duì)Degree值按降序進(jìn)行排序后，篩選出24個(gè)(Degree >20) 差異基因?yàn)楹诵幕?。獲得圖4，通過(guò)構(gòu)建差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們可以得到網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因與其他基因的作用關(guān)系。Betweenness Centrality 表示基因在網(wǎng)絡(luò)中的pathway中的樞紐評(píng)分，分值越高表示在網(wǎng)絡(luò)中的樞紐位置更中心。Degree表示基因和其他基因關(guān)聯(lián)的個(gè)數(shù)，如Degree=10代表與該基因有相互作用關(guān)系的基因有10個(gè)，Degree越大，代表與它有相互作用的基因越多。表3是基因的Degree和Betweenness Centrality，并按照Degree進(jìn)行排序，獲得24個(gè)關(guān)鍵基因。

圖4 基因網(wǎng)絡(luò)圖

表3 關(guān)鍵基因

3 討論

隨著對(duì)分子遺傳學(xué)的研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在DNA分子結(jié)構(gòu)不變的情況下，一些修飾可以引起生物性狀改變，這種改變具有遺傳性稱為表觀遺傳。表觀遺傳學(xué)即主要包含DNA甲基化、蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼 RNA 調(diào)控等。DNA甲基化中最主要的修飾機(jī)制，主要影響基因表達(dá)和細(xì)胞分化發(fā)育方面[3]。哮喘是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重影響人類健康，近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高[4]。對(duì)哮喘的表觀遺傳學(xué)研究，尤其是甲基化研究，逐漸成為哮喘發(fā)病機(jī)制研究[5-6]的新方向。本研究對(duì)外周血基因組DNA甲基化差異進(jìn)行生物學(xué)分析，獲得了差異基因1 493個(gè)，甲基化程度上調(diào)基因有923個(gè)，甲基化程度降低基因有570個(gè)，對(duì)比哮喘患者和健康對(duì)照者基因芯片結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分促進(jìn)哮喘發(fā)病的基因甲基化程度降低，如IL-1R1，ADM33等，而抑制哮喘發(fā)病的多數(shù)基因甲基化程度升高，如STAT3，IL-2等，說(shuō)明基因甲基化水平的變化會(huì)造成基因表達(dá)譜的區(qū)別，抑制哮喘發(fā)病的基因表達(dá)降低而促進(jìn)哮喘發(fā)病基因表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)原有的平衡被打破，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以及許多細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫及炎癥反應(yīng)從而參與哮喘發(fā)生發(fā)展，也進(jìn)一步表明[7]表觀遺傳學(xué)改變是參與哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。

GO通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因的功能主要集中在突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、突觸膜形成、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、肌肉收縮、無(wú)機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等方面，說(shuō)明神經(jīng)通路激活及肌肉收縮與哮喘發(fā)病有密切關(guān)系[8]。KEGG通路分析顯示甲基化差異基因主要涉及磷脂酶D信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、Rap通路、細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路等功能，提示哮喘的發(fā)生發(fā)展是多途徑分子生物學(xué)信號(hào)通路共同作用所致。PI3K信號(hào)通路通過(guò)刺激支氣管平滑肌細(xì)胞增殖，黏附分子誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集進(jìn)入氣道，鈣離子通道激活致使支氣管平滑肌收縮等從而參與哮喘發(fā)病進(jìn)程[9-10]。而磷脂酶D信號(hào)通路及Rap通路在哮喘中的作用機(jī)制尚未明確，是哮喘研究的新方向。

對(duì)1 493個(gè)差異基因進(jìn)行基因相互作用進(jìn)一步分析，按照基因相關(guān)度獲得關(guān)鍵基因24個(gè)。TNF編碼腫瘤壞死因子參與氣道炎癥發(fā)生發(fā)展，是判斷支氣管哮喘病情嚴(yán)重程度和治療效果的重要指標(biāo)之一；IL-10可以限制炎癥反應(yīng)以及自身免疫反應(yīng)，在哮喘的發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)中起到對(duì)哮喘有利的作用[11-12]。CREBBP基因編碼的蛋白質(zhì)CBP，參與氣道重塑[13]。IGBT2和CD44分別編碼CD18和CD44蛋白，是黏附分子中整合素家族的重要成員，其高表達(dá)會(huì)加重氣道炎癥，使氣道的高反應(yīng)性增加[14]。HDAC4和HDAC5屬于組蛋白乙?；讣易?，通過(guò)維持氣道Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答、T細(xì)胞免疫應(yīng)答平衡和抑制優(yōu)勢(shì)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，其活性與哮喘發(fā)生相關(guān)[15]。PRKCA表達(dá)蛋白激酶C-α促進(jìn)平滑肌增生，激活嗜酸性粒細(xì)胞，參與哮喘發(fā)病[16]。GNB1、PIK3R1、PIK3R2、GNGT、CDC5L、DLG4、UBR4等基因在哮喘中的作用尚待探究，進(jìn)一步深入研究將會(huì)為哮喘靶向治療和早期診斷提供新的方向和策略。