賈 勇，趙金秀

（河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院，河北 廊坊 065000）

慢粒靈顆粒由三棱、莪術(shù)、青黛、山豆根、桃仁、紅花、黃藥子7 味中藥組方，具有活血化瘀、散結(jié)消的作用，臨床主要用于治療瘀血阻滯證慢性粒細(xì)胞白血?。?］。方中三棱有消積止痛、破血行氣作用［2］；紅花有散瘀止痛、活血通經(jīng)作用，其活血成分為黃酮類成分［3-4］，包括羥基紅花黃色素A、山柰素、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 等。目前，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅見(jiàn)青黛和山豆根的薄層色譜鑒別。青黛和山豆根主要是發(fā)揮清熱解毒、消腫利咽的作用［5］。青黛中的靛玉紅有治療慢性粒細(xì)胞白血病作用［6］，且根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物基于性-效-藥（Q-Marker）的概念［7-8］，中藥質(zhì)量標(biāo)志物主要是指能與中藥功能密切相關(guān)的成分，可作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制與中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念關(guān)系不緊密，具有一定缺陷。本研究中對(duì)處方中青黛采用薄層色譜（TLC）法進(jìn)行鑒別，采用超高效液相色譜（UPLC）法測(cè)定慢粒靈顆粒（膠囊）中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B，對(duì)其紅花藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，可為提高和完善慢粒靈顆粒（膠囊）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Water ACQUITY H-Class 型超高效液相色譜儀，包括Empower 3 工作站（美國(guó)沃特世儀器公司）；Sartorius BT124 型電子天平（北京賽多利斯儀器公司，精度為萬(wàn)分之一）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；Mili-Q 型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

慢粒靈顆粒（醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)分別為20190320，20190706，20180516，規(guī)格為每袋15 g）；慢粒靈膠囊（ 醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)分別為20190704，20190730，20190801，規(guī)格為每粒0.45 g）；羥基紅花黃色素A 對(duì)照品（批號(hào)為111637-201308，含量為96.5%），靛藍(lán)對(duì)照品（批號(hào)為110716-201612），靛玉紅對(duì)照品（批號(hào)為110717-201805），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為MUST-19041506，含量99.72%），紅花黃色素B 對(duì)照品（批號(hào)為MUST-19041507，含量99.68%），均購(gòu)自成都曼斯特公司；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；三氯甲烷、丙酮、甲苯、三氟乙酸、磷酸二氫銨、磷酸，均為分析純，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 青黛TLC 鑒別

取3 批慢粒靈顆粒各1 袋，研細(xì)，稱取粉末各10 g；取膠囊20 粒，研細(xì)，分別置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷20 mL，超聲處理（功率為350 W，頻率為50 kHz）10 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品，加氯仿制成每1 mL 各含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5 ∶4 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫，0～5.5 min 時(shí)2%A～5%A，5.5～8.4 min 時(shí)5%A～9%A，8.4～19.8 min 時(shí)，9%A～20%A，19.8～22 min 時(shí)20%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：380 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品12.52 mg、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷10.08 mg 和紅花黃色素B 9.96 mg，精密稱定，置同一25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取慢粒靈顆粒（批號(hào)為20190320）10 袋，研細(xì)；取慢粒靈膠囊20 粒，研細(xì)。精密稱取上述粉末各1.0 g 置150 mL 具塞錐形瓶中，分別加25% 甲醇50 mL，超聲處理（功率為350 W，頻率為50 kHz）30 min，取出，放冷，加25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取慢粒靈顆粒處方量的1 /10，制備缺紅花藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備紅花陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述3 種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。詳見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，紅花陰性樣品對(duì)3 種成分的測(cè)定無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：取上述對(duì)照品貯備溶液作為5 號(hào)對(duì)照品溶液，分別精密吸取50，100，1 000，2 000 μL，分別置10 mL 容量瓶中，依次作為1～4 號(hào)對(duì)照品溶液。分別取上述1～5 號(hào)對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、相對(duì)應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：分別精密收取線性關(guān)系考察項(xiàng)下的1號(hào)、3 號(hào)和5 號(hào)對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果1 號(hào)對(duì)照品溶液中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.98%，2.03%，1.65%（n=6）；3 號(hào)對(duì)照品溶液中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3-O-β-葡萄糖苷、紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.37%，1.55%，1.12%（n=6）；5 號(hào)對(duì)照品中羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、紅花黃 色 素B 峰 面 積 的 RSD 分 別 為0.62% ，1.05% ，0.88%（n=6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

圖2 慢粒靈顆粒中3 種黃酮類成分高效液相色譜圖

表1 3 種成分線性關(guān)系考察結(jié)果（ n=3）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取上述供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)考察24 h，記錄色譜峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 峰面積的RSD 分別為1.98%，2.32%，2.56%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取慢粒靈顆粒（批號(hào)為20190320），依法制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果羥基紅花黃色素A、6-羥基山柰酚-3- Oβ-葡萄糖苷和紅花黃色素B 的平均含量分別為6.08，0.66，2.16mg/g，RSD 分別為2.01%，1.52%，1.36%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取羥基紅花黃色素A 28.62 mg、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷9.73 mg，精密稱定，置同一10 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解稀釋至刻度，作為待加溶液1；取紅花黃色素B 8.28 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，作為待加溶液2；取已知含量的慢粒靈顆粒6 份，精密稱定，每份0.5 g，置具塞錐形瓶中，向上述6 份樣品中分別加入上述待加溶液1 和待加溶液2 各1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批慢粒靈顆粒/膠囊，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 慢粒靈顆粒/膠囊中3 種黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

預(yù)試驗(yàn)中，首先采用TLC 法對(duì)方中君藥莪術(shù)和三棱進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者相同成分較多，陰性成分互相有干擾，通過(guò)調(diào)整展開劑比例和不同的供試品制備方法均未能排除干擾，因此未將君藥列入本研究。方中青黛的主要成分靛玉紅具有消炎、抗腫瘤等藥理活性，故選擇TLC 法進(jìn)行鑒別控制；紅花有活血化瘀、消炎、抗腫瘤的功效，其中以黃酮類成分羥基紅花黃色A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 含量較高，因此，選擇上述3 種成分為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

首先考察不同提取溶劑（水、25%甲醇、75%甲醇和甲醇）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑時(shí)，羥基紅花黃色A 和紅花黃色素B 的含量下降較大；純水作為溶劑時(shí)，色譜峰雜質(zhì)較多，6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷峰形拖尾；25%甲醇作為提取溶劑時(shí)，3 種成分的含量相對(duì)較大，且峰形良好，分離度大于1.5。因此，選擇25%甲醇作為提取溶劑。采用三因素三水平（制備方法為回流、超聲、索氏提??；超聲時(shí)間為20，30，40 min；超聲功率為150，300，450 W）進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)3 種提取方法提取率相差不大，超聲功率對(duì)其也無(wú)明顯影響，但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，含量逐漸增大，30 min 與40 min 含量接近。因此，確定供試品制備方法為25%甲醇超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz），提取30 min。

3.3 測(cè)定條件選擇

采用PDA 檢測(cè)器對(duì)3 種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)于380 nm 波長(zhǎng)處3 種成分的干擾較小，峰形對(duì)稱，分離效果好，故選擇380 nm 作為3 種成分含量測(cè)定的最佳波長(zhǎng)。由于黃酮類化合物易溶于甲醇、乙腈，因此流動(dòng)相的選擇先后采用甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液等多種流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離較好，峰形對(duì)稱。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的TLC 法專屬性強(qiáng)，無(wú)干擾；UPLC法可同時(shí)測(cè)定紅花中羥基紅花黃色A、6-羥基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和紅花黃色素B 3 種黃酮類成分的含量，且具有分析速度快、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于慢粒靈顆粒中青黛和紅花藥材的質(zhì)量控制，同時(shí)為提高慢粒靈顆粒（膠囊）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。