（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶526061）

常山胡柚是常山特有的一種柑桔地方品種，是自然界中的蕓香科植物柚與甜橙的天然雜交品種，具有獨特的風味[1]。目前，胡柚在加工產(chǎn)業(yè)中主要是將果肉制成果汁型飲料以及果脯，廢棄大量的果皮果渣，而胡柚皮中含有豐富的果膠、多酚類化合物包括黃酮類物質(zhì)以及揮發(fā)性精油等，適合將其進行開發(fā)利用，提高胡柚的整體價值[2-3]。由于合成抗氧化劑對人體存在著一定的潛在風險，故人們對黃酮等天然抗氧化劑越來越重視，需求量也逐年增大[4]。傳統(tǒng)上，用水蒸氣蒸餾法、索式提取法、回流提取法等方法提取時工序繁雜，耗時長，成分復雜并且損失大[5]。對胡柚皮用超聲輔助提取或者表面活性劑協(xié)同微波輔助提取的研究報道較常見[6-9]，而將超聲和表面活性劑結(jié)合起來提取胡柚皮黃酮的研究還鮮見報道。本試驗采用表面活性劑與超聲波協(xié)同輔助提取胡柚皮中的黃酮類物質(zhì)，能夠更大程度上使原料中的提取物溶解在溶液中，能有效地提高提取效率[10-13]。利用Design-Expert.V8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗[14-16]，并在優(yōu)化試驗的結(jié)果上進行驗證得出最佳提取條件，本試驗研究旨在為胡柚皮的進一步綜合利用提供參考。

1 材料與儀器

胡柚：浙江省衢州市常山縣；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：分析純，山東西亞化學股份有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，LAS）、吐溫20（Tween-20）、聚乙二醇400（polyethylene glycol，PEG400）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇、無水乙醇：分析純，廣州化學試劑廠；蘆丁：98%，成都曼思特生物科技有限公司。

SK8200H超聲波清洗器：上?？茖С晝x器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；AUY120電子分析天平：日本島津公司；DHG-9070B數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；TD3-800B臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

2 試驗方法

2.1 胡柚皮中總黃酮的提取工藝流程

胡柚→清洗→剝皮切塊→烘箱干燥（60℃）→粉碎→過篩→稱量→表面活性劑+乙醇溶液浸提→超聲輔助提取→離心→抽濾→顯色定容→吸光度測定→總黃酮提取率計算

2.2 操作要點

將胡柚皮切成小塊，放進烘箱中設(shè)置60℃烘干至恒重，然后用粉碎機將其打成粉末狀后過60目篩。參考文獻[17-20]配制蘆丁標準液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液、60%乙醇溶液等溶液，并繪制蘆丁標準曲線。

在100 mL的碘量瓶中放入稱好的1 g胡柚皮粉，按照設(shè)定的料液比加入一半體積的表面活性劑溶液和乙醇溶液，放置在已提前40℃恒溫的超聲器中，超聲一定時間后取出，用半微量抽濾裝置進行抽濾。將濾渣和另外一半體積的表面活性劑溶液和乙醇溶液搖勻，繼續(xù)超聲相同時間，再抽濾，合并兩次抽濾液，搖勻。將混合均勻的濾液倒入10 mL的離心管中，設(shè)置離心機以4 000 r/min離心15 min后，用吸量管準確移取上層離心液0.5 mL于25 mL比色管中，進行顯色處理。以樣品提取液空白進行調(diào)零，在最大吸收波長510 nm處依次測定吸光度，將吸光度代入標準曲線回歸方程得出提取出來后總黃酮的質(zhì)量濃度c（mg/mL），從而計算出總黃酮提取率。平行3次重復試驗，取其均值。提取率計算公式：

式中：c為樣品系列濃度梯度顯色液中所含總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為溶液稀釋倍數(shù)；m為稱取的胡柚皮粉末質(zhì)量，g；1 000為單位換算系數(shù)。

2.3 單因素試驗

單因素研究時，設(shè)計表面活性劑質(zhì)量分數(shù)為1%，超聲時間為5 min，功率為500 W，乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶20（g/mL），在提取溫度為40℃下進行輔助提取。當研究到相應(yīng)因素時，改變其因素值進行研究，其他因素條件保持不變。在探究每一個單因素后，將其較佳的條件替換后再進行下一個因素探究。

2.3.1 表面活性劑類型的影響

準確稱取1 g的胡柚皮粉4份，按照2.2試驗方法，計算出總黃酮提取率。探究不同種類表面活性劑：吐溫 20（Tween-20）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、聚乙二醇 400（PEG400）對提取率的影響。

2.3.2 SDS質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響

準確稱取1 g的胡柚皮粉6份，參照2.2的試驗方法，計算出總黃酮提取率。探究加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的 SDS對提取率的影響。

2.3.3 超聲時間對提取率的影響

準確稱取1 g的胡柚皮粉6份，在SDS質(zhì)量分數(shù)為2.5%的條件下，參照2.2中的試驗方法，計算出總黃酮提取率。探究超聲時間為 5、10、15、20、25、30 min對提取率的影響。

2.3.4 乙醇濃度對提取率的影響

準確稱取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS質(zhì)量分數(shù)為2.5%，超聲時間為25 min條件下，參照2.2中的試驗方法，計算出總黃酮提取率。探究50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液對提取率的影響。

2.3.5 料液比對提取率的影響

準確稱取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS質(zhì)量分數(shù)為2.5%，超聲時間為25 min，70%乙醇溶液條件下，參照2.2中的試驗方法，計算出總黃酮提取率。探究料液比為 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）時對提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

綜合單因素試驗操作與結(jié)果，選取SDS質(zhì)量分數(shù)、超聲時間、乙醇濃度、料液比等4個因素進行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)擬合得出優(yōu)化工藝條件，設(shè)計如表1所示。

表1 因素水平設(shè)計表Table 1 Factor level design

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可見，在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，標準曲線方程式為 y=12.825x-0.007 1，即：A=12.825 c-0.007 1，決定系數(shù)R2為0.999 2，表明蘆丁溶液與吸光度在選取的試驗范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.2 單因素試驗對提取率的影響

3.2.1 表面活性劑類型對提取率的影響

不同種類表面活性劑對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 不同種類表面活性劑對提取率的影響Fig.2 Effect of different kinds of surfactants on extraction rate

由圖2可知，加入不同類型表面活性劑由于破壞細胞膜能力不一樣使之浸出物也存在差異性，故在超聲輔助提取中提取率也存在差異，PEG400的提取率最低，SDS的提取率最高，LAS次之，因此試驗選擇SDS作為提取胡柚皮總黃酮的表面活性劑。

3.2.2 SDS質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響

SDS質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響見圖3。

圖3 SDS質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響Fig.3 Effect of SDS quality score on extraction rate

由圖3可知，在0.5%～3.0%范圍內(nèi)隨著SDS質(zhì)量分數(shù)的增加總黃酮提取率逐漸增加，當SDS用量達到2.5%時，提取率最大，大于2.5%時提取率降低。由于表面活性劑到達一定濃度程度后，對總黃酮的增溶作用不再增強，溶液中形成的膠束數(shù)量呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，因此試驗選擇SDS最佳用量為2.5%。

3.2.3 超聲時間對提取率的影響

超聲時間對提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate

由圖4可知，胡柚皮中總黃酮提取率隨超聲時間而逐漸增加，當達到25 min時達到最大值，超過25 min后，提取率呈現(xiàn)下降趨勢。超聲波輔助提取會產(chǎn)生的空化效應(yīng)使得原料中更多黃酮溶解到乙醇溶液中，但超聲時間過長，部分黃酮結(jié)構(gòu)會被破壞，同時有其他雜質(zhì)溶出，使得黃酮提取率降低。因此試驗選擇超聲輔助提取最佳時間為25 min。

3.2.4 乙醇濃度對提取率的影響

乙醇濃度對提取率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate

由圖5可知，在乙醇體積分數(shù)為70%時提取率達到最大值，超過此濃度后，提取率呈現(xiàn)下降趨勢。隨著乙醇濃度的增加，植物細胞的通透性提高，有更多的黃酮溶于乙醇溶液中，但超過一定限度后，高濃度的乙醇對其他物質(zhì)影響更大，從而溶解出更多的醇溶親脂性雜質(zhì)，影響總黃酮提取率。因此試驗選擇最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

3.2.5 料液比對提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖6。

圖6 料液比對提取率的影響Fig.6 Effect of raw material and solution ratio on extraction rate

由圖6可知，隨著提取溶液量的增加，總黃酮提取率先增加，當料液比為1∶30（g/mL）時提取率最大，隨后，提取率逐漸減少。當溶液量增大時，樣品粉末與溶劑的接觸面濃度差變大，導致傳質(zhì)速率增加，黃酮類化合物更容易溶出；但濃度差到達一定程度后，其他非黃酮類化合物也會相繼溶出，雜質(zhì)增多，溶液黏度發(fā)生改變，影響了黃酮的溶出，從而提取率降低。因此試驗選擇最佳料液比為1∶30（g/mL）。

3.3 響應(yīng)面方案設(shè)計及結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

使用Design-Expert.V8.0.6軟件對表2中響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到胡柚皮中總黃酮提取率（Y），SDS質(zhì)量濃度（A），超聲時間（B），乙醇濃度（C），料液比（D）的二次回歸方程為：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.098AB-0.036AC-0.023AD+0.000 4BC-0.087BD+0.020CD+0.000 0166 7A2-0.037B2-0.062C2-0.057D2?；貧w模型的方差分析如表3所示。

從表 3 可知其自變量 A，B，C，D，AC，BD，B2，C2，D2的 P值均小于0.01，表明單因素A、B、C、D交互項AC、BD 與二次項 B2、C2、D2都對試驗具有極顯著影響，而其他項 AB、AD、BC、CD、A2則影響不顯著。因此，二次多項回歸方程可修正為：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.036AC-0.087BD-0.037B2-0.062C2-0.057D2，對胡柚皮中總黃酮提取率的大小影響順序為：料液比（D）＞超聲時間（B）＞乙醇濃度（C）＞SDS質(zhì)量濃度（A）。模型的R2=0.952 0，校正決定系數(shù) R2（adj）=0.903 9＞0.80 試驗誤差較小，表明模型擬合度較好，試驗可操作。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

續(xù)表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

3.4 各因素交互作用分析

經(jīng)過分析各因素間的交互作用，剔除不顯著項，顯著項如圖7所示。

圖7 兩因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of two-factor interaction

乙醇濃度的曲線比SDS質(zhì)量濃度的曲線走勢更為陡峭，SDS質(zhì)量濃度的曲線走勢平緩。乙醇濃度對提取率的影響比SDS質(zhì)量濃度更為顯著。二者等高線圖形狀呈現(xiàn)橢圓形，表明二者具有顯著的交互作用，且在SDS濃度為2.0%～2.25%，乙醇濃度為75%～80%的區(qū)域內(nèi)提取率取得最大值。料液比的曲線比超聲時間走勢更為陡峭。料液比對提取率的影響比提取時間更為顯著。二者等高線圖形狀呈現(xiàn)橢圓形，表明二者具有顯著的交互作用，且在超聲時間為20 min～25 min，料液比為 1 ∶35（g/mL）～1 ∶40（g/mL）的區(qū)域內(nèi)提取率取得最大值。此結(jié)果分析與方差分析結(jié)果相一致。

3.5 驗證優(yōu)化條件

根據(jù)模型擬合得到胡柚皮中總黃酮的最佳提取工藝條件在SDS質(zhì)量濃度為2.0%，超聲時間為21.9 min，乙醇濃度為 76.54%，料液比為 1 ∶40（g/mL）時，總黃酮提取率可達到2.001%。從實際可操作角度考慮，將最佳提取工藝條件修正為SDS質(zhì)量濃度為2.0%，超聲時間為22 min，乙醇濃度為77%，料液比為1∶40（g/mL），在此條件下進行試驗，最后得到胡柚皮中總黃酮提取率為1.973 1%。與模型擬合得到的預測值相對誤差為1.4%，從而證明該響應(yīng)面優(yōu)化模型所得的數(shù)據(jù)準確，工藝條件可行性較高，具有實際生產(chǎn)應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

胡柚皮一直作為垃圾被廢棄，其皮中的營養(yǎng)成分豐富，經(jīng)加工利用可以大大提高胡柚皮的應(yīng)用價值。本試驗通過在乙醇溶液提取胡柚皮總黃酮的基礎(chǔ)上，采用表面活性劑超聲波輔助提取，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果表明此法提取能有效地提高胡柚皮總黃酮的提取率。經(jīng)過優(yōu)化驗證，最佳提取工藝條件為：SDS質(zhì)量分數(shù)為2.0%，超聲時間為22 min，乙醇濃度為 77%，料液比為 1 ∶40（g/mL），提取溫度為40℃。在此條件下，胡柚皮中總黃酮提取率可達1.973 1%。試驗期望能為進一步研究胡柚皮黃酮的提取提供一定的理論基礎(chǔ)，將胡柚皮變廢為寶，提高胡柚的整體價值。