楊兆甜， 吳亞婕， 王 瑩， 王雅靜， 呂青骎，2， 王 瑋*，2

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院， 江蘇 南京210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京），江蘇 南京210095）

目前，我國在畜牧養(yǎng)殖方面使用較多的獸藥有β-受體激動劑類、磺胺類、砜類抑制劑類以及喹諾酮類等[1-2]。 獸藥的濫用易使畜牧產(chǎn)品遭受嚴重污染[3]，藥品經(jīng)代謝進入動物源性食品中，之后可通過食物鏈在人體蓄積， 不僅能使人體產(chǎn)生抗藥性、引起過敏反應、影響腸道內(nèi)菌群[4]，還能導致中毒等不良反應[5-6]。 因而，動物源性食品的獸藥殘留問題引起了廣泛關注[7-9]。

目前，動物源性食品獸藥殘留的檢測方法主要有毛細管電泳法 （Capillary Electrophoresis，CE）[10]、高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11-12]、免疫法（Immunoassay，IA）[13-14]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （Ultra Performance Liquid Chromatography/tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[15-16]等。 其中，CE 法可高效分離化合物，但重現(xiàn)效果不理想[17]；HPLC 法檢測快速、價格較低，但靈敏度較差[18-19]；IA 法檢測快速、靈敏，但假陽性率偏高[20]。 而且以上方法大多按照獸藥種類分成若干種[21-22]，檢測效率較低，且獸藥高通量同時檢測分析受制于缺乏統(tǒng)一的前處理方法難以實現(xiàn)[23-24]。作者在采用Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱凈化和提取藥物的基礎上，通過優(yōu)化前處理方法，建立了一種高通量快速測定豬肉中20種獸藥殘留的UPLC-MS/MS 方法。 該方法可以彌補常規(guī)檢測方法的缺陷，旨在為我國動物源性食品安全監(jiān)測體系建設、國際貿(mào)易中藥物殘留檢測提供技術保障，同時有助于提高我國動物源食品的安全性，維護我國消費者的權益。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料

advance EDI 純水儀： 購于德國Sartorius 公司；I-class & Xevo TQ-S Micro型超高效液相色譜質(zhì)譜儀： 購于美國Waters 公司；N-EvAP型24 管氮吹儀： 購于美國Organomation 公司；D-16C 高速冷凍離心機：購于德國Sartorius 公司；Oasis PRiME HLB小柱：購于美國Waters 公司。

1.2 試驗試劑

試驗材料為市售生鮮豬肉，購于江蘇省南京市超市及農(nóng)貿(mào)市場。

標準品：沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、克倫特羅、妥布特羅、氯丙那林、磺胺甲惡唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、氨苯砜、達氟沙星、沙拉沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、培氟沙星、地塞米松、替米考星、紅霉素、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D3、特布他林-D9、克倫特羅-D9、妥布特羅-D9、氯丙那林-D7、恩諾沙星-D5：購于德國Dr. Ehrenstorfer 公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：購于美國Fisher 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理準確稱取生鮮豬肉樣品制得的肉糜2.50 g，將其放置于50 mL 離心管中，依次加入20 μL 內(nèi)標混合工作液和10 mL 體積分數(shù)80%的乙腈水溶液， 渦旋振蕩1 min， 超聲提取3 min，10000 r/min 離心5 min，獲取上清液。 在固相萃取裝置上放置Oasis PRiME HLB 小柱， 取5 mL上清液加載到固相萃取柱，收集過濾液。 并取4 mL濾液在50 ℃水浴的條件下用氮氣吹干，經(jīng)1 mL 體積分數(shù)為10%的甲醇水溶液復溶后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，復溶液進行UPLC-MS/MS 分析。 采用陰性樣品參照上述步驟進行空白試驗；在陰性樣品中加入混合標準溶液，并參照上述步驟進行加標試驗。

1.3.2 標準溶液的配制單標儲備液配制：準確稱取20種待測藥物的標準品，以甲醇溶液作為溶劑，配制為一定質(zhì)量濃度（20～100 μg/mL）的單標儲備液。

6 類藥物混合標準溶液配制： 分別取同類別中一定量的單標儲備液并用甲醇定容，使6 類藥物混合標準溶液的質(zhì)量濃度均為10.00 μg/mL。

混合標準溶液的配制：分別移取6 類藥物混合標準溶液1.00 mL，并用甲醇溶液定容至10.00 mL，得到1.00 μg/mL 的混合標準溶液。

內(nèi)標溶液的配制：各種內(nèi)標以甲醇溶液為溶劑配制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的內(nèi)標儲備液； 分別移取各種內(nèi)標儲備液1.00 mL， 用甲醇溶液定容至10.00 mL，得到1.00 μg/mL 的內(nèi)標混合溶液。

1.3.3 UPLC-MS/MS 法的建立色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；以體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液和體積分數(shù)0.1%的甲酸乙腈溶液作為流動相；流速保持在0.3 mL/min；柱溫保持在30℃；進樣量為10 μL；色譜柱的洗脫方式采用梯度洗脫，其梯度洗脫條件如表1 所示。

質(zhì)譜條件： 電噴霧正離子模式（electrospray ionization in positive mode，ESI＋）； 掃描模式為多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；脫溶劑氣流量為1000 L/h；錐孔氣流量為20 L/h；離子源溫度保持在500 ℃。 監(jiān)測參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.3.4 檢出限、定量限以及線性范圍的確定參照1.3.3 的色譜條件和質(zhì)譜條件進行測定，以3 倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N=10）計算定量限（limit of quantitation，LOQ）。 在豬肉空白樣品中添加混合標準溶液，從而建立基質(zhì)匹配標準曲線，線性范圍為0.5～20 μg/kg，共設定6個點， 以豐度較強的子離子進行定量分析，豐度次之的子離子進行定性分析，以質(zhì)譜圖峰面積與藥物質(zhì)量分數(shù)關系作圖，橫坐標（X）為藥物質(zhì)量分數(shù)（μg/kg），縱坐標（Y）為峰面積，繪出標準曲線。 其中，β-受體激動劑類和喹諾酮類獸藥采用內(nèi)標法確定質(zhì)量分數(shù)，其他種類獸藥的質(zhì)量分數(shù)采用外標法進行確定。

1.3.5 準確度和精密度試驗在陰性生鮮豬肉制成的肉糜中分別添加1、5 μg/kg 和10 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，每個質(zhì)量分數(shù)設6個平行。 以平均回收率（recovery）計算結果評價方法的準確度，根據(jù)平行樣品的相對標準偏差 （Relative Standard Deviation，RSD）評價該方法的精密度。

表2 20種獸藥質(zhì)譜條件Table 2 MS parameters of 20 kinds of veterinary drugs

1.3.6 方法的實際應用選用市售生鮮豬肉樣品10 份，其中5 份采購自超市，5 份采購自農(nóng)貿(mào)市場，參照1.3.1 和1.3.3 進行樣品前處理和上機測定，以驗證該方法的實際應用效果。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的確定

參考相關文獻，提取多獸藥殘留時普遍使用乙腈、甲醇等溶液或者乙腈、甲醇和一定比例其他溶液混合用作提取液。 作者比較了體積分數(shù)1%乙酸乙腈、 體積分數(shù)0.2%甲酸-80%乙腈水和體積分數(shù)80%乙腈水溶液作為提取溶劑時的回收率（加標質(zhì)量分數(shù)為10 μg/kg）。 表3 表明：選用體積分數(shù)80%乙腈水溶液作為提取溶劑時，20種藥物的回收率均在60%～120%； 以體積分數(shù)1%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑時，僅有7種藥物的回收率在60%～120%；而體積分數(shù)0.2%甲酸-80%乙腈水作為提取溶劑時，僅有8種藥物的回收率在60%～120%，測定準確性較低。 因此，選用體積分數(shù)80%的乙腈水作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑加標回收率的比較Table 3 Comparison of spiked recovery with different extracting solutions

2.2 復溶溶劑的確定

在氮吹完成后進行復溶操作時，復溶溶劑的選擇會影響測定的準確度與精密度。 作者在以體積分數(shù)80%乙腈水作為提取溶劑的基礎上，比較體積分數(shù)10%甲醇水、 體積分數(shù)15%乙腈水和體積分數(shù)0.1%甲酸-50%乙腈水溶液分別用作復溶溶劑時的回收率（加標質(zhì)量分數(shù)為10 μg/kg）。表4 表明：當體積分數(shù)10%甲醇溶液作為復溶溶劑時，所有藥物的回收率均在60%～120%之間；在體積分數(shù)15%乙腈溶液用作復溶溶劑時， 有10種藥物的回收率位于該范圍內(nèi)； 而使用體積分數(shù)0.1%甲酸-50%乙腈溶液復溶時，僅有9種藥物的回收率位于該范圍內(nèi)。因此，選擇體積分數(shù)10%的甲醇溶液作為復溶溶劑。

表4 不同復溶溶劑加標回收率的比較Table 4 Comparison of spiked recovery with different dissolving solutions

2.3 標準曲線、相關系數(shù)、檢出限及定量限

本試驗中喹諾酮類和β-受體激動劑類獸藥的標準曲線采用內(nèi)標法繪制，其他種類獸藥標準曲線均采用外標法進行繪制，20種藥物的線性方程、相關系數(shù)、 檢出限以及定量限見表5。 20種藥物在0.5～20 μg/kg 內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關系， 其r 值均大于0.995。 檢測的20種藥物中，18種藥物的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.7 μg/kg；其余2種藥物（地塞米松和替米考星） 的檢出限分別為1μg/kg 和5 μg/kg，定量限分別是3.3 μg/kg 和16.7 μg/kg。

2.4 方法精密度與準確度

分別在陰性豬肉糜中添加1、5、10 μg/kg 3個質(zhì)量分數(shù)的混合標準溶液，采用UPLC-MS/MS 檢測以確定樣品中獸藥殘留的回收率及RSD，且每個質(zhì)量分數(shù)設6個平行。 表6 表明：20種獸藥3個不同質(zhì)量分數(shù)的平均回收率在62.1%～118.3%，RSD 位于0.4%～16.7%之間。

2.5 方法實際應用結果

選用10 份市售生鮮豬肉作為供試材料，并設置陽性對照和陰性對照控制樣品的質(zhì)量。 表7 表明：僅有一份超市銷售的豬肉樣品中檢測出磺胺二甲嘧啶，質(zhì)量分數(shù)為9.94 μg/kg。

3 結 語

表5 20種藥物線性方程、相關系數(shù)、檢出限以及定量限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，LOD and LOQ of 20 drugs

表6 20種藥物的加標回收率以及相對標準偏差（n=6）Table 6 Spiked recovery and relative standard deviation（n=6）of 20 drugs

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度好、 準確度高，同時能夠突破現(xiàn)行有效檢測方法分類檢測的局限，實現(xiàn)多種類獸藥殘留的高通量同時檢測。 作者應用UPLC-MS/MS 法檢測豬肉中6 類共20種獸藥殘留，所有檢測目標物分離良好，重現(xiàn)性好，并且采用Oasis PRiME HLB 小柱凈化樣品，使得前處理方法簡便快捷，檢測效率提高。

續(xù)表6

表7 生鮮豬肉20種獸藥殘留檢測結果Table 7 Detection results of 20 drugs in meat

作者試驗20種獸藥殘留的檢出限可達到0.5～5.0 μg/kg， 其中喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的檢出限分別低于國家現(xiàn)行有效標準GB/T 21312-2007 和出入境檢疫行業(yè)標準SN/T 1777.2-2007 中規(guī)定的1～3 μg/kg[25]和20 μg/kg[26]；磺胺類獸藥殘留的檢出限能達到現(xiàn)行有效檢測方法農(nóng)業(yè)部1025 號公告中規(guī)定的0.5 μg/kg[27]。 低、中、高3個濃度水平的加標回收率在62.1%～118.3%， 均在國家現(xiàn)行有效標準GB/T 27404-2008 中規(guī)定的60%～120%內(nèi)[28]，RSD 為0.4%～16.7%，表明該方法具有良好的準確度和精密度。 該方法在實際應用中，檢測效果良好，可用于豬肉樣品中多種獸藥殘留的高通量快速檢測。