衣潔菡 趙愛華 王金榮 郭德慧 李燕青 仲米存

摘 要：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴增新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因，通過多重序列比對檢測2 種魷魚之間的多態(tài)性位點。根據(jù)2 種魷魚的特異性位點分別設(shè)計2 種魷魚的品種特異性引物，并利用多重PCR實現(xiàn)2 種魷魚品種的特異性鑒定和區(qū)分。結(jié)果表明：建立的品種特異性PCR鑒別體系對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚分別擴增出214 bp和339 bp的品種特異性條帶，該方法的檢測限低至0.1 ng，且能檢測出新西蘭柔魚中1%的北太平洋柔魚摻入，并能有效檢測市場上2 種魷魚及其復(fù)配魚糜制品的原料來源。

關(guān)鍵詞：魷魚;新西蘭柔魚;北太平洋柔魚;多態(tài)性位點;品種特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Species-Specific Polymerase Chain Reaction for Authentication of Nototodarus sloanii and Ommastrephes bartramii

YI Jiehan1， ZHAO Aihua2，*， WANG Jinrong1， GUO Dehui1， LI Yanqing1， ZHONG Micun1

（1.Yantai New Era Health Industry Co. Ltd.， Yantai 264006， China; 2.Economic Development and Technological Innovation

Bureau of Yantai Economic and Technological Development Area， Yantai 264006， China）

Abstract： In this study， the mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene of the two squid species， Nototodarus sloanii and Ommastrephes bartramii， were amplified by polymerase chain reaction （PCR） and sequenced， and DNA polymorphisms were analyzed by multiple sequence alignment. Species-specific primers were designed for each species according to their specific sites， and multiplex PCR was conducted for molecular discrimination of N. sloanii and O. bartramii. As a result， N. sloanii and O. bartramii gave specific amplicons of 214 bp and 339 bp， respectively. The developed species-specific PCR system could detect 1% of intentional adulteration of O. bartramii in N. sloanii with a detection limit of as low as 0.1 ng of genomic DNA. Therefore， it could be useful to identify N. sloanii and O. bartramii and blended surimi from both species available on the market.

Keywords： squid; Nototodarus sloanii; Ommastrephes bartramii; polymorphic site; species-specific polymerase chain reaction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200416-095

中圖分類號：TS254.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）06-0080-05

引文格式：

衣潔菡， 趙愛華， 王金榮， 等. 新西蘭柔魚與北太平洋柔魚的品種特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定[J]. 肉類研究， 2020， 34（6）： 80-84. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200416-095.? ? http：//www.rlyj.net.cn

YI Jiehan， ZHAO Aihua， WANG Jinrong， et al. Species-specific polymerase chain reaction for authentication of Nototodarus sloanii and Ommastrephes bartramii[J]. Meat Research， 2020， 34（6）： 80-84. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200416-095.? ? http：//www.rlyj.net.cn

魷魚屬于軟體動物門頭足綱（Cephalopoda），是頭足類中最重要的經(jīng)濟資源之一，魷魚加工也是國內(nèi)水產(chǎn)品加工業(yè)的主要組成部分之一[1-2]。魷魚含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸以及具有各種生理功能的嘌呤、?；撬岷湍懝檀嫉?，是被消費者廣泛接受的營養(yǎng)、健康的水產(chǎn)品來源[3]。市場上的魷魚品種主要來源于柔魚科（Ommastrephidae）和槍烏賊科（Loliginidae）[4]。與柔魚科相比，槍烏賊科魷魚的產(chǎn)量較少，因此魷魚的開發(fā)種類以柔魚科為主[5]。新西蘭柔魚（Nototodarus sloanii）屬于褶柔魚亞科雙柔魚屬，又稱新西蘭雙柔魚。新西蘭柔魚僅分布在新西蘭海域，由于其每年的捕撈量有配額限制，產(chǎn)量較少，因此價格較高[6]。北太平洋柔魚（Ommastrephes bartramii）隸屬于柔魚亞科柔魚屬，近年來平均年產(chǎn)量為8～12 萬t，是西北太平洋海域重要的經(jīng)濟類頭足資源之一[7]。北太平洋柔魚的肉質(zhì)較薄，口感發(fā)面，價格相對于新西蘭柔魚較低。新西蘭柔魚和北太平洋柔魚形態(tài)相似，市場上2 種柔魚的產(chǎn)品也多以凍品及魷魚筒、魷魚圈、魷魚片等初加工形式存在，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢驗方法無法對失去形態(tài)特征的魷魚來源進行

鑒別[8-9]，使得2 種魷魚品種的混淆或摻假成為可能。因此，開發(fā)簡單、有效的新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的分子生物學(xué)鑒定方法不僅可以保護消費者的合法權(quán)益，而且可以規(guī)范魷魚市場，避免貿(mào)易摩擦。

DNA分子標(biāo)記是以個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是直接在DNA分子水平上檢測生物間的

差異[10]。因此，DNA分子標(biāo)記在生物體各個組織、不同生長發(fā)育階段均可檢測到，不受環(huán)境因素、個體生長發(fā)育階段及加工過程的影響[11]。近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在物種來源鑒定和檢測中呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢[12]。在動物的基因組序列中，核DNA和線粒體DNA為常用的兩大類分子標(biāo)記基因。與核DNA相比，線粒體DNA是母系遺傳的單倍體，具有分子質(zhì)量小、沒有內(nèi)含子、很少有等位基因重組現(xiàn)象等特點[13]。相對于其他線粒體DNA的編碼基因，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因包含的遺傳信息量大，同時又有一定的進化速率，更適合分析親緣關(guān)系密切的類群，目前已成為動物物種鑒定的公認(rèn)條形碼[14]。本研究對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的線粒體COⅠ基因進行擴增和序列比對，擬從中挖掘2 種魷魚的特異性位點，并建立用于2 種柔魚品種區(qū)分和鑒定的DNA分子標(biāo)記方法，以期為加強魷魚的質(zhì)量管理及規(guī)范魷魚市場的標(biāo)簽制度提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的樣品材料由煙臺同德食品有限公司提供，秘魯莖柔魚樣品購自市場。魷魚樣品的代碼和產(chǎn)地如表1所示。

海洋動物基因組DNA提取試劑盒（EE151-01）、2×PCR SuperMix預(yù)混液（AS111-11）、凝膠提取回收試劑盒（EG101-01）、瓊脂糖凝膠 北京全式金生物技術(shù)有限公司;引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

TG18W臺式高速微量離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;Mastecycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 艾本德（中國）有限

公司;BIS910凝膠成像系統(tǒng) 東勝創(chuàng)新生物科技有限

公司;Mupid-2Plus水平電泳槽 日本Mupid公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚基因組DNA的提取

用新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的冷凍樣品作為原料，用滅菌手術(shù)剪剪下約30 mg魷魚組織，剪碎后放入已滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨至粉末，利用海洋動物基因組DNA提取試劑盒（EE151-01），嚴(yán)格按照說明書的步驟提取DNA。提取的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 線粒體COⅠ基因的擴增及測序

選用通用引物擴增新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的線粒體COⅠ基因。正向引物為COⅠF：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，反向引物為COⅠR：5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[15]。PCR反應(yīng)體系總體積為20 ?L，其中包含10 ng模板DNA、0.5 ?mol/L正向引物、0.5 ?mol/L反向引物、10.0 ?L 2×PCR SuperMix，加超純水補齊至20 ?L。PCR反應(yīng)過程：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取3 ?L擴增產(chǎn)物，用加入染色劑溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測，觀察條帶是否為干凈、清晰的單一條帶。PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.3 品種特異性引物的設(shè)計

2 種魷魚測序后的COⅠ序列用SeqMan軟件組裝，通過Clustal Omega軟件將2 種魷魚的COⅠ序列與GenBank中其他魷魚品種的COⅠ序列進行比對[16]，選擇新西蘭柔魚和北太平洋柔魚品種穩(wěn)定遺傳的單核苷酸多態(tài)性（single nueleotide polymorphism，SNP）位點，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5分別設(shè)計新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的正向特異性引物（NSF和OBF），利用2 種魷魚的相同序列設(shè)計通用的反向引物（NOR）。引物的熔解溫度設(shè)置為54～60 ℃，長度18～25 bp。正向品種特異性引物的3末端通過改變單個堿基的方式人為引入錯配堿基，以保證引物對特定魷魚品種的絕對特異性[17]。

1.3.4 新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的分子鑒定

利用設(shè)計的特異性引物對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚進行多重PCR鑒定。PCR鑒定的反應(yīng)體系為20 ?L，其中包含10 ng魷魚基因組DNA或2 種魷魚基因組DNA的混合物、0.5 ?mol/L引物NSF、0.5 ?mol/L引物OBF、1.0 ?mol/L引物NOR、10.0 ?L 2×Premix DNA polymerase。PCR反應(yīng)過程：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫結(jié)束反應(yīng)。取3 ?L擴增產(chǎn)物混合染料后，用加入染色劑溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，然后在紫外成像系統(tǒng)下進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種柔魚品種特異性位點的選擇

將新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的COⅠ序列用SeqMan軟件拼接組裝，2 種魷魚的GenBank序列號分別為KY771095和KX591660（表1）。利用Clustal Omega比對分析新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的品種特異性位點，并將2 種魷魚的COⅠ序列與GenBank中已登記的COⅠ序列比對，確定品種特異性位點的遺傳穩(wěn)定性。分別選取新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的特異性位點設(shè)計品種特異性引物。如圖1所示，根據(jù)211～214 bp處的多態(tài)性位點設(shè)計北太平洋柔魚的品種特異性引物，選擇337～340 bp處的多態(tài)性位點設(shè)計新西蘭柔魚的品種特異性引物，并選擇合適序列設(shè)計新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的通用反向引物。

2.2 引物設(shè)計

利用Primer Premier 5設(shè)計2 種魷魚的品種特異性引物及其反向引物，3 條引物的退火溫度盡量保持一致。選擇211～214 bp的SNP位點作為3末端設(shè)計北太平洋柔魚的品種特異性引物OBF（5-TGACTAGTTCCCTTAATGCTG-3）。在引物OBF的序列中，倒數(shù)第1、3、4位堿基與新西蘭柔魚均不相同。根據(jù)新西蘭柔魚337～340 bp處的特異性位點，設(shè)計新西蘭柔魚的品種特異性引物NSF（5-AGGTACTGGTTGAACAGTTCAC-3），將倒數(shù)第3位堿基由T改為C，以保證引物NSF對新西蘭柔魚的絕對特異性。利用510～532 bp處的序列設(shè)計新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的通用反向引物NOR（5-AATGGCRGTAATAAATACAGATC-3）。3 條引物的相對位置如圖1所示。

2.3 多重PCR鑒定

利用圖1所示的3 條引物組合對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚進行多重PCR鑒定，模板分別采用新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的模板DNA及二者的DNA混合樣品，混合樣品中北太平洋柔魚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、10%、50%。

泳道M. 100 bp Plus DNA Ladder;泳道1、2. 北太平洋柔魚DNA;泳道3～5. 新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的混合DNA，分別含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、10%、50%北太平洋柔魚;泳道6、7. 新西蘭柔魚DNA。

由圖2可知，3 條引物組合對不同魷魚樣品擴增出了不同位置的條帶。對不同樣品的擴增條帶利用膠回收試劑盒進行回收，純化后進行雙向測序，結(jié)果表明，新西蘭柔魚的特異性條帶大小為214 bp，而北太平洋柔魚的特異性條帶大小為339 bp，且二者的序列和圖1中完全一致。由此可見，引物NSF及OBF分別對各自的目標(biāo)魷魚品種新西蘭柔魚和北太平洋柔魚具有絕對的品種特異性。對于新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的DNA混合樣品，3 條引物組合的多重PCR結(jié)果同時擴增出214 bp和339 bp的目標(biāo)條帶。在模板總含量為10 ng的條件下，該檢測體系可以檢測出新西蘭柔魚中1%的北太平洋柔魚摻入。因此，本研究建立的多重PCR鑒定體系可以有效地對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚進行特異性區(qū)分和鑒定，檢測限可低至0.1 ng。

2.4 市售樣品的檢測

為了檢驗所建立的方法對市售樣品來源檢測的有效性，利用圖1所示的3 條引物組合，以市售新西蘭柔魚、北太平洋柔魚樣品及2 種魷魚的復(fù)配魚糜DNA為模板，以超純水和秘魯莖柔魚的DNA為陰性對照進行檢測，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如1.3.4節(jié)所述。

泳道M. 100 bp Plus DNA Ladder;泳道1. 超純水;泳道2、3. 秘魯莖柔魚DNA;泳道4、5. 北太平洋柔魚DNA;泳道6、7. 新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的復(fù)配魚糜DNA;泳道8、9. 新西蘭柔魚DNA。

由圖3可知，不同魷魚樣品擴增產(chǎn)物的條帶位置和圖2一致，2 個新西蘭柔魚樣品擴增出214 bp的特異性條帶，2 個北太平洋柔魚樣品擴增出339 bp的特異性條帶，復(fù)配魚糜則同時擴增出214 bp和339 bp的目標(biāo)條帶，表示樣品中同時含有新西蘭柔魚和北太平洋柔魚，超純水和秘魯莖柔魚作為陰性對照則沒有條帶產(chǎn)生。因此，本研究建立的多重PCR鑒定體系可以對新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的市售樣品及其復(fù)配魚糜的來源進行準(zhǔn)確鑒定和檢測，可用于市場上新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的快速特異性鑒定。

3 結(jié) 論

隨著我國遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)的飛速發(fā)展，魷魚的捕撈量和消費量逐年上升，已成為我國水產(chǎn)加工業(yè)的主要組成部分之一[18]。魷魚的來源接近300 種，但由于不同魷魚品種的營養(yǎng)價值和口感差異，只有少量魷魚具有商業(yè)價值，因此不同品種的魷魚價格差異較大[4]。由于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和蛋白質(zhì)鑒定方法對魷魚初加工產(chǎn)品來源的鑒定存在局限性，因此亟需建立不同魷魚品種的鑒定方法，保證產(chǎn)品質(zhì)量，促進魷魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多DNA分子標(biāo)記技術(shù)被應(yīng)用于不同魷魚品種的鑒定，如熒光定量PCR[19]、限制性片段長度多態(tài)性[20]、法醫(yī)信息核苷酸測序（forensically informative nucleotide sequencing，F(xiàn)INS）[8]、DNA條形碼[21]

等。熒光定量PCR技術(shù)是近年來研究的熱點，既能實現(xiàn)物種鑒定又可以達到定量的目的，具有更高的特異性和靈敏性[22]，并且操作簡單、重復(fù)性好[23]，但是由于魷魚品種鑒定時需使用熒光定量PCR儀及TaqMan探針，限制了該方法在一般的分子生物學(xué)實驗室的應(yīng)用。FINS和DNA條形碼技術(shù)均是利用未知物種的DNA條形碼序列與數(shù)據(jù)庫中的已知物種序列進行比對和聚類分析，從而將個體定位到生物類群中。但由于不同類群可能有不同的種內(nèi)和種間距離，上述方法也存在一定的爭議[24]。SNP分子標(biāo)記是由于基因組中插入、缺失、置換和顛換單個核苷酸所引起的變異，與上述方法相比，基于SNP分子標(biāo)記的位點特異性PCR技術(shù)檢測快速、易實現(xiàn)自動

化[25-27]，是目前非常有發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記方法。郝娜等[28]

利用SNP分子標(biāo)記實現(xiàn)了科氏滑柔魚與劍尖槍烏賊之間的區(qū)分和鑒定，田瀟然等[29]利用16S rRNA基因序列對秘魯莖柔魚和澳洲雙柔魚進行了鑒定。線粒體COⅠ基因具有足夠的種內(nèi)保守性和種間特異性[30]，可作為通用的DNA條形碼區(qū)分大多數(shù)動物物種，并且由于線粒體具有更大的基因拷貝數(shù)，在加工過程中保持相對完整，因此更適用于魷魚初加工及深加工產(chǎn)品原料來源的鑒定。

在線粒體COⅠ基因中，檢測到新西蘭柔魚和北太平洋柔魚的品種特異性位點，通過與GenBank中相應(yīng)魷魚品種的序列進行比對，選取遺傳穩(wěn)定的特異性位點進行品種特異性引物設(shè)計，并通過在引物中均引入錯配堿基的方式，大大提高了目標(biāo)片段擴增的特異性。本研究建立的3 條引物的PCR鑒定體系在降低非特異性擴增的同時，大大提高了目標(biāo)片段擴增的特異性，且該檢測體系無需再對樣品進行測序分析，可以檢測出新西蘭柔魚中1%的北太平洋柔魚摻入，檢測限可低至0.1 ng。與傳統(tǒng)需要測序的方法相比，本研究建立的鑒定方法具有簡單、準(zhǔn)確的優(yōu)點，可以有效地對新西蘭柔魚、北太平洋柔魚及市售產(chǎn)品進行特異性區(qū)分和鑒定。水產(chǎn)品標(biāo)簽制度的實施必須建立在對源性成分快速、準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)之上，本方法的建立為我國魷魚市場的規(guī)范管理提供了技術(shù)支持，也可為其他水產(chǎn)品源性成分的檢測提供借鑒。

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