易柯含

摘 要：目的：以實驗室養(yǎng)殖和市場銷售的正常三疣梭子蟹為研究對象，探究飼料磷脂水平對甲殼動物酚氧化酶活性的影響，為三疣梭子蟹的營養(yǎng)免疫學研究和梭子蟹飼料的開發(fā)提供科學依據(jù)。方法：將達到試驗規(guī)格的三疣梭子蟹隨機分成A1、A2、B1、B2四組。A1和A2組為蛋黃磷脂平行組，用以投喂該兩組的配合飼料中添加足量蛋黃磷脂為主要磷脂源。B1和B2組為大豆磷脂平行組，用以投喂組B1、B2的配合飼料中添加足量大豆磷脂為主要磷脂源。人工飼養(yǎng)8周后，從A1、A2、B1、B2各組隨機抽取4只蟹，測定其血清和HLS的酚氧化酶活性，并與市場組（C組）梭子蟹血清和HLS的酚氧化酶活性作比較。結(jié)果：血細胞樣本中，市場組總活力均值為2.67，高于試驗各組的活力均值（1.13～1.47），差異顯著，而試驗各組之間沒有顯著性差異。A1、A2、B1、B2四組比活率分別為0.58、0.38、0.49、0.32，四組之間不存在顯著性差異，而市場組比活率為2.20，顯著低于試驗各組。血清樣本中，試驗各組的總活力值均在1.40～1.99之間，組間不存在顯著性差異;A1、B1、B2組的比活率值都在1.97～2.68之間，無顯著差異。B組比活率平均值為4.44，與A1、B1、B2組有顯著差異。結(jié)論：作為磷脂源，卵黃磷脂和大豆磷脂對梭子蟹HLS的酚氧化酶活性均無顯著影響，而試驗組血清酚氧化酶活性比活率明顯高于市場組，說明在一定程度上，卵黃磷脂和大豆磷脂對血清中的酚氧化酶活性有促進作用。

關鍵詞：三疣梭子蟹;磷脂;非特異性免疫;酚氧化酶

三疣梭子蟹具有肉質(zhì)好、食物鏈短、生長快、產(chǎn)量高等優(yōu)點。20世紀80年代后期開始，由于過度捕撈，東海中南部海區(qū)梭子蟹資源出現(xiàn)衰退[1-2]。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由高密度養(yǎng)殖、過剩投餌等原因帶來的養(yǎng)殖環(huán)境的急劇惡化，已經(jīng)造成了由細菌、病毒引起的傳染性疾病，這給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]，嚴重阻礙了梭子蟹養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)的病害防治方法主要是依靠化學類合成藥物，但實踐證明，長期使用抗生素會在動物體內(nèi)造成藥物殘留物的沉積，這不僅降低了水產(chǎn)品的質(zhì)量，同時也降低了甲殼動物自身的免疫力，并對人類健康造成諸多影響。國內(nèi)對這類藥物的使用已做出了明確限制[4-5]。

甲殼動物的細胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成，體液免疫包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)、各種凝集素及抗菌肽等。酚氧化酶原活化系統(tǒng)又被稱為酚氧化酶（PO）前體格狀物，其結(jié)構(gòu)成分，如革蘭氏陰性菌中的脂多糖（LPS）和真菌中的β-1，3-葡聚糖能特異性活化絲氨酸蛋白酶（PPA），PPA被激活后，作為激活劑進一步激活酚氧化酶原[6-7]。PO一般以無活性proPO的形式存在于甲殼動物體內(nèi)，它主要來源于血細胞中的顆粒細胞和半顆粒細胞，入侵的細菌等異物作用于甲殼動物的這兩種細胞，刺激細胞產(chǎn)生胞吐作用，并進行脫顆粒激活，使proPO釋放PO，同時產(chǎn)生76 KD 蛋白和α-巨球蛋白。這一反應鏈的短暫氧化產(chǎn)物（單酚和酚）對微生物具有殺傷能力;而黑色素則可抑制病原體胞外蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)酶的活性，并介導黑化反應，在病原體表面形成小結(jié)塊，殺死病原體[8-9]。酚氧化酶活性（Apo）因甲殼動物所處環(huán)境條件、生理狀態(tài)和營養(yǎng)水平的不同而有所差別。研究表明，Apo值的高低可以作為反映甲殼動物免疫狀況的指標，并從側(cè)面反映出甲殼動物健康狀況及免疫靈敏性之不同[10]。有關磷脂對甲殼動物免疫狀況的影響在國內(nèi)外鮮見報道，所以，本研究以實驗室養(yǎng)殖和市場銷售的正常三疣梭子蟹為研究對象，分別以足量蛋黃磷脂和大豆磷脂為主要磷脂源，制成了兩種配合飼料，用以投喂實驗室養(yǎng)殖梭子蟹，以Apo為主要免疫性能評價指標，并與市場銷售的正常三疣梭子蟹Apo作比較，通過測定其體液免疫中的相關酶含量，以達到探討飼料磷脂對三疣梭子蟹Apo的影響的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 三疣梭子蟹種苗，產(chǎn)于浙江省海洋研究所西軒廠區(qū)，分為20個組，每個組放在圓柱形的水缸中，水缸中擁有1個由三層八邊形組成的蟹籠，采用微循環(huán)換水，給每個養(yǎng)殖缸提供不間斷的沙濾海水（15 L/min）;每個缸內(nèi)都安置1個氣石，保持24 h增氧，使溶解氧保持在7 mg/L左右;水溫控制在24～30℃;鹽度大約在30;水體pH值7.6左右;采用自然光照，使各試驗組有相近的光照強度，每天用不同組分的飼料早晚喂料1次，養(yǎng)殖10周。試驗時，每個組隨機取5只三疣梭子蟹用于試驗。樣本用于試驗前，經(jīng)過饑餓處理（空腹1d）。

1.1.2 養(yǎng)殖管理 以魚粉（質(zhì)量分數(shù)60%）為主要蛋白源，試驗共準備了2種人工配合飼料。在基礎配方中分別添加足量蛋黃磷脂、大豆磷脂，并分別記為飼料組1、2。過篩制粒后，于-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?。先將試驗用的梭子蟹在實驗室條件下進行暫養(yǎng)，適應一段時間后正式開始試驗，將達到試驗規(guī)格的三疣梭子蟹隨機分成A1、A2、B1、B2四組，放入八邊形白色塑料蟹籠中，使每個試驗組個體總質(zhì)量盡量相近。A1、A2兩組投喂飼料組1，B1、B2兩組投喂飼料組2。每天于9∶00、17∶00各投料1次，按體重的4%投喂。每隔一段時間，換1/4桶水，排掉桶底污物。

1.1.3 儀器 消毒注射器、燒杯、玻璃棒、量筒、膠頭滴管、500 mL容量瓶、電子天平、pH測定儀、移液槍（Eppendorf）、吸頭、吸頭盒、1.5 mL離心管、T10基本分散機、CT15RE型高速（冷凍）微量離心機、BIO-RAD iMark酶標儀、96孔板、冰袋等。

1.2 方法

1.2.1 血樣的采集 養(yǎng)殖8周時間后，從每個組隨機抽取4只梭子蟹采血，樣本在試驗前，已經(jīng)過饑餓處理（停料1d）。用消毒的5 mL注射器從三疣梭子蟹背殼部上方插入，在心臟位置抽取血淋巴。注射器中預先吸入1 mL已滅菌的預冷抗凝劑（0.14 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L葡萄糖、0.03 mol/L檸檬酸三鈉、0.026 mol/L檸檬酸、pH值5.0）。

1.2.2 PO活力的測定 （1）經(jīng)過2次離心，用Tris-HCl buffer沖洗過的血細胞樣本中注入100 μL Tris-HCl buffer，使用T10基本分散機超聲破碎Hemocytes（操作3s、停5s，反復8次，冰上操作），在12 000 r/min（配平到0.01位）、4℃條件下，離心10 min，取上清，即血細胞破碎液上清（HLS）（血清總活力的測定參照步驟2進行）;（2）將20 μL HLS添加到96孔板，再分別用移液槍注入200 μL L-DOPA（5 mmol/L的L-LOPA溶液，稱量約0.1 g，用100 mL雙蒸水溶解），另設一組陰性孔對照，只加Tris-HCl緩沖液，靜置10～15 min，室溫下（22℃）溫育。用BIO-RAD iMark酶標儀測定樣品在A490 nm波長下的光吸收值，讀數(shù)7次，間隔時間設置為5 min。將光吸收每分鐘增長 0.001定義為1個活力單位（Unit），計算公式為式（1）：

PO=（OD-ODO-ODL）/t（1）

式（1）中，OD代表所選時間段終點處的光吸收值;ODO代表所選時間段起點處的光吸收值;ODL代表這段時間內(nèi)，t則代表反應時間，只加Tris-HCl 緩沖液的陰性孔，其光吸收的增加值。

2 結(jié)果與分析

2.1 血細胞和血清樣本的處理

超低溫凍存的實驗室養(yǎng)殖梭子蟹血清樣品在5 000 r/min、4℃條件下，離心5 min后，出現(xiàn)了少量白色塊狀絮凝，而在市場購買的正常梭子蟹，其血清并未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。

2.2 蛋白濃度標準方程

0.5 mg/mL BSA的標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL梯度加到96孔酶標板中，用Tris-HCl buffer分別補足至20 μL，則其稀釋后濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，每個濃度梯度設置了3個平行樣，計算出每個濃度中3個平行樣吸光度的平均值，以BSA濃度為橫坐標、其光吸收隨時間的變化值為縱坐標，用Excel軟件作圖得到其標準曲線和蛋白質(zhì)標準方程y=0.536 4x+0.265 6（圖1）。

2.3 試驗樣品蛋白濃度的測定

將HLS和血清樣本在A595 nm波長的吸光度（OD值）代入標準方程y=0.536 4x+0.265 6中，即可得到對應的蛋白濃度值x。以樣品B2-2為例，其血清樣本按4、5、10、20μL梯度注入到96孔酶標板中，用Tris-HCl buffer分別補足至20μL，則其稀釋倍數(shù)分別為5、4、2、0。樣本在A595 nm處的吸光度（OD）見表1，計算在這個濃度下的血清蛋白濃度值，并乘以稀釋倍數(shù)，則得到了其血清蛋白的原濃度值，又由于未稀釋組的細胞蛋白濃度為0.791>0.5（標準蛋白曲線中BSA的最大濃度值），此數(shù)值落在了置信區(qū)間之外，應舍棄，所以其原濃度值為（1.165+1.472+1.178）/3=1.272。

2.4 試驗樣品酚氧化酶活性測定

根據(jù)0.5h內(nèi)光吸收值隨時間的變化量，用Excel軟件得到各組的回歸曲線，通過R2來選擇代入合適的OD、ODO值（圖2）。加入20 μL血清的樣品A1-1光吸收隨時間變化的趨勢線，R2=0.995 7，則可用5、30min兩個時間點對應的光吸收值代入式（2）：

PO=（OD-ODO-ODL）/t（2）

加入20μL血清的血樣A1-1其總活力為1.68 U，梭子蟹血細胞和血清的蛋白濃度及PO活性見表2～3。

用SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)，血細胞樣本中，市場組（C組）總活力均值為2.67，高于A1、A2、B1、B2各組的活力均值（1.13～1.47之間），差異顯著（P<0.05），而A1、A2、B1、B2組之間沒有顯著性差異（P>0.05）;A1、A2、B1、B2四組比活率分別為0.58、0.38、0.49、0.32，四組相比不存在顯著性差異，而C組比活率為2.20，顯著低于其他四組（表4）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，大豆磷脂組HLS比活率與蛋黃磷脂組HLS比活率接近。市場組HLS比活率高于各試驗組，因此認為，飼料中添加足量蛋黃磷脂或大豆磷脂，對于血細胞中PO含量的影響不大。本試驗中，試驗組血細胞比活率均值顯著低于市場組，通過對試驗組血細胞的觀察計數(shù)發(fā)現(xiàn)，蛋黃磷脂組顆粒細胞均值和半顆粒細胞均值均顯著低于透明細胞數(shù)量。在大豆磷脂組中，情況類似，其透明細胞均值顯著高于血淋巴中的顆粒細胞數(shù)和半顆粒細胞數(shù)。因此認為，造成實驗室養(yǎng)殖梭子蟹血細胞Apo較低的原因是血液中顆粒細胞和半顆粒細胞數(shù)量不足引起的。血清樣本中，蛋黃磷脂組比活率略高于大豆磷脂組，但兩者均顯著高于市場組比活率，本研究結(jié)果表明，足量的蛋黃磷脂或大豆磷脂均能顯著提高三疣梭子蟹血清中的Apo。

參考文獻

[1]樓倩，等.胰蛋白酶、SDS對三疣梭子蟹酚氧化酶活力的影響[J].江西水利科技，2017，43（1）：9-13.

[2]侯迎梅，袁野，陸游，等.三疣梭子蟹幼蟹對大豆卵磷脂的需要量[J].水產(chǎn)學報，2016，40（11）：1753-1764.

[3]丁立云，付輝云，侯迎梅，等.飼料磷脂對已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢發(fā)育、組織學和卵黃蛋白原表達的影響[J].水產(chǎn)學報，2018，42（3）：366-375.

[4]吳仁福，龍曉文，侯文杰，等.飼料中添加雨生紅球藻粉對三疣梭子蟹雌體卵巢發(fā)育、色澤、抗氧化能力和生化組成的影響[J].水生生物學報，2018，42（4）：38-48.

[5]翟少偉，蘇保元，張春曉.飼料中膽固醇和卵磷脂水平及添加表面活性素對凡納濱對蝦蛻殼間期的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2017，29（7）：2460-2467.

[6]陳夏月，任永寬，李連君，等.臺風過境對養(yǎng)殖三疣梭子蟹抗氧化系統(tǒng)及Na～+，K～+-ATP酶活性的影響[J].海洋學研究，2018，36（3）：101-106.

[7]王洪斌，金學萍，肖龍海，等.富硒海洋小球藻對三疣梭子蟹血清中部分免疫活性酶的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2016，55（14）：3687-3689.

[8]呂艷芳，等.曲酸對南美白對蝦酚氧化酶活性和結(jié)構(gòu)的影響[J].食品科學，2017，38（18）：22-28.

[9]李秀霞，等.超高壓處理對南美白對蝦多酚氧化酶活性和品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)，2019，40（2）：117-121.

[10]蘇志星，何杰，許文軍，等.擠壓脅迫對三疣梭子蟹抗氧化和應激能力的影響[J].浙江海洋學院學報（自然科學版），2018（2）：95-100.

Abstract：Objective ?The effect of feed phospholipid level on phenoloxidase activity of crustaceans was studied by taking Portunus trituberculatus which was cultured in laboratory and sold in the market to provide scientific evidence for immunological studies and the development of the Portunus trituberculatus feed production.Method Portunus trituberculatus reach the experimental specifications were randomly divided into A1，A2，B1，B2 four groups（experimental group）.Group A1，A2 for the egg yolk phospholipid group，for feeding group A1，A2 mating feed add sufficient amount of egg yolk phospholipid as phospholipidas source.Group B1，B2 as soybean lecithin group，for feeding group B1，B2 of compound feed，add a sufficient amount of soybean phospholipid as phospholipid source.Farming 8 weeks，from A1，A2，B1，B2 in each group were randomly selected four crab measured serum and HLS Apo，and compared with the serum and HLS Apo of Portunus trituberculatus in the market group（C group）.Result Samples of blood cells，total vitality mean of the market group was 2.67，which was higher than the dynamic mean of each group of the experiment（inter 1.13 to 1.47），and experiments between the groups have no significant difference.The survival rate of A1，A2，B1，B2 was 0.58，0.38，0.49，0.32，respectively，no difference among the four groups，and the market compared activity was 2.20，significantly lower than the experimental groups.Serum samples，the experiment the total vitality value of each group were in the range of 1.40 to 1.99，which did not exist significant differences between the two groups.The survival rate value of group A1，B1，B2 were in the range of 1.97 to 2.68，no significant difference.The average survival rate group B was 4.44，with group A1，B1，B2 had a significant difference.Conclusion As a source of phospholipids，egg yolk lecithin and soybean lecithin on the phenoloxidase activity of HLS from Portunus trituberculatus had no significant impact.The specific activity of serum Apo in the experimental group was significantly higher than that in the market group，to a certain extent，egg yolk lecithin and soybean lecithin could promote phenoloxidase activity in serum.

Keywords：Portunus trituberculatus;phospholipid;non-specific immune;phenoloxidase

（責任編輯 唐建敏）